猪捷申病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立和初步应用

秦毅斌 ， 苏乾莲 ， 赵 硕 ， 卢冰霞 ， 何 颖 ， 周展宏 ， 袁婷婷 ， 李 斌 ， 段群棚 ， 欧阳康 ， 赵 武

(1.广西兽医研究所 广西兽医生物技术重点实验室 ， 广西南宁530001 ； 2.广西大学动物科学技术学院 ， 广西南宁530005)

猪捷申病(Porcine teschen disease，PTD)，又称塔尔凡病或脑脊髓炎，是由猪捷申病毒(Porcine teschovirus，PTV)感染引起的一种猪病毒性传染病。该病首次于1929年在捷克斯洛伐克的捷申地区发现，故命名为“捷申病”，随后传播至北美、非洲、澳大利亚和日本等国家，目前已散布于世界各养猪国家[1]。猪群感染PTV后，主要表现为腹泻、脑脊髓灰质炎[2]、肺炎、心包炎、心肌炎、皮肤损坏等症状，母猪还可导致繁殖障碍[3]，感染发病猪具有较高的病死率，给养猪业带来了较大经济损失。

PTV属于小RNA病毒科(Picornaviridae)捷申病毒属(Teschovirus)成员，病毒粒子呈球形，外层包裹衣壳，无脂蛋白，病毒基因组为单股正链RNA，长约7.2 kb，仅含有1个完整的编码1个多聚蛋白的开放阅读框(ORF)，该多聚蛋白被蛋白水解酶裂解为非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D和结构蛋白L、VP1、VP2、VP3、VP4[4-5]。PTV至少有11个血清型[6]，并且还不断出现新的血清型PTV12[7]、PTV13[8]。研究表明，我国猪群PTV感染较为普遍。2003年，哈尔滨兽医研究所从内蒙古某猪场首次分离到PTV Swine/CH/IMH/03株[9]，之后相继分离到JF613株、jilin/2003株、HB株、Fuyu/2009株和CH/JX/JJ株等多个毒株并进行全基因组测序分析[10-13]。

为建立更为敏感、特异、快速的PTV检测方法，本试验通过GenBank中登录的PTV的11种血清型基因序列并进行比对分析，以AF231769为模板在保守区域基因组5′非编码区设计合成特异性引物和TaqMan探针，优化反应条件后，建立了检测PTV的一步法RT-qPCR方法，并对采自广西各地的猪腹泻病例粪样进行PTV初步检测应用。

1 材料与方法

1.1 毒株 PTV、猪丁型冠状病毒(PDCoV)1468B株[14]、猪流行性腹泻病毒(PEDV)750A株[15]、猪细小病毒(PPV)N株[16]，均为广西兽医研究所病毒研究室分离保存；猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、A群猪轮状病毒(PRoVA)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪嵴病毒(PKV)及猪圆环病毒2型(PCV-2)等阳性样品均为本实验室保存。

1.2 临床样品 235份粪样及肠道组织为2018年3月—2019年4月采自广西各地发生猪腹泻病例的规模猪场。

1.3 主要仪器和试剂 实时荧光定量PCR仪QuantStudioTM5为美国应用生物技术公司(ABI)产品；梯度PCR仪为美国伯乐(BioRad)公司产品；分光光度计(UV-2450)购自日本岛冿科技公司。pMD18-T载体、反转录试剂盒、一步法RT-qPCR试剂盒[One Step PrimeScriptTMqRT-PCR Kit(Perfect Real Time)]、DNA凝胶回收试剂盒等，均为宝生物工程(大连)有限公司产品；病毒DNA/RNA抽提试剂盒为Axygen生物科技有限公司产品；质粒小量抽提试剂盒、2×TaqPCR Master，均购自北京天根生化科技有限公司；E.coliDH5α感受态细胞为全式金科技公司产品。

1.4 引物及探针的设计 根据GenBank上登录的11种血清型PTV的基因组序列进行序列比对确定保守区域，以PTV Talfan株(AF231769)的基因组序列为模板，在保守区域基因组5′非编码区设计2对特异性引物和TaqMan探针，其中引物PTV-F、PTV-R用于扩增保守区域并构建重组质粒，引物PTV-R-F、PTV-R-R和探针PTV-Probe用于荧光定量反应。引物序列见表1，由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.5 粪便样品的处理及病毒RNA的提取 粪便样品及肠道内容物按照1∶10比例用PBS(0.01 mol/L, pH 7.2)稀释制成的悬液，涡旋震荡充分混匀后，4℃ 10 000 r/min离心10 min后收集上清，立即用于RNA提取或置于-40℃冻存备用。依据Axygen生物科技有限公司DNA/RNA提取试剂盒说明书进行PTV病毒液或者样品上清核酸的提取。

1.6 pMD18-PTV质粒标准品的制备 以PTV分离毒株提取的RNA为模板，按照反转录试剂盒说明书合成cDNA。用引物PTV-F和PTV-R进行PCR扩增PTV基因组5′端保守区域的片段，50 μL反应体系：2×TaqPCR Master 25 μL、上下游引物各1 μL(表1)、cDNA模板4 μL，加ddH2O 补足50 μL。反应程序: 95 ℃ 5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35个循环；72 ℃延伸7 min，最后12 ℃结束反应低温保存。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的片段切胶回收纯化后连接至pMD18-T克隆载体，转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞，提取重组质粒进行酶切鉴定及PCR鉴定，阳性质粒pMD18-PTV送宝生物工程(大连)有限公司进行测序。

表1 引物和TaqMan探针序列Table 1 Primers and TaqMan fluorescent probe

1.7 一步法RT-qPCR反应条件与体系优化 按照试剂盒推荐说明书进行PTV一步法RT-qPCR扩增反应并进行优化。反应体系预设为20.0 μL，包括2×One-Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL，TaKaRaExTaqHS(5 U/μL)0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL，引物PTV-R-F、PTV-R-R各0.4 μL，探针PTV-Probe 1 μL、ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL、RNA模板2.0 μL，加ddH2O 5.2 μL补足20.0 μL。反应程序: 42 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 45 s，45个循环；每个循环延伸结束时采集荧光信号。将引物和探针在终浓度为0.2～0.8 μmol/L 范围内进行浓度优化，以确定一步法荧光定量RT-PCR反应的最佳引物和探针浓度。

1.8 标准曲线的建立 参照文献[17]的方法，根据测定的质粒核酸浓度计算质粒标准品的拷贝数，计算公式：拷贝/mL =(6.02×1023拷贝/mol)×(质粒浓度)/(MWg /mol)。将质粒标准品10倍 倍比系列稀释成含有4.6×108～4.6×102拷贝/μL的7个梯度，以此作为模板按照所建立及优化的一步法RT-qPCR反应进行扩增。以Ct值为纵坐标，以不同浓度标准品拷贝数的常用对数为横坐标，推导出标准线性回归方程，进而绘制标准曲线。

1.9 敏感性试验 分别以4.6×100～4.6×109拷贝/μL 浓度的标准质粒pMD18-PTV作为模板，对该方法的敏感性进行测定，以确定所建立的PTV一步法RT-qPCR方法的最低检测下限。

1.10 特异性试验 利用所建立的方法，以PTV为阳性对照，同时检测TGEV、PEDV、PDCoV、PRRSV、PKV、PRoVA、CSFV、PPV、PRV、PCV-2等常见的猪病毒，以验证该方法的特异性。

1.11 重复性及稳定性试验 取质粒标准品pMD18-PTV的低、中、高(4.6×102、4.6×104、4.6×106拷贝/μL)3个浓度作为模板，用优化后的一步法RT-qPCR进行检测，每个浓度设3个重复，根据各稀释度的Ct值计算标准差和变异系数，进行组内重复性试验。将上述3个浓度的标准质粒保存于-20℃ 冰箱，之后每间隔1周以相同的反应条件进行检测，连续做3次，计算各浓度模板Ct值的标准差和变异系数，来验证该方法的稳定性及组间重复性。

1.12 临床样品的检测 对235份来自广西各地不同规模养猪场腹泻病例的粪便样品或肠道内容物，应用本试验建立的PTV一步法RT-qPCR方法进行检测，同时与先前普通RT-PCR的检测结果进行比较，了解广西猪群PTV的感染状况。

2 结果

2.1 反应体系与反应条件优化 通过对反应体系中引物与探针浓度的优化，确定了一步法RT-qPCR检测PTV的最佳反应体系：2×One-Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL，TaKaRaExTaqHS(5 U/μL)0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL，引物PTV-R-F(10 μmol/L)、PTV-R-R(10 μmol/L)各0.4 μL，探针PTV-Probe(2 μmol/L)1 μL、ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL、RNA模板2.0 μL，加ddH2O 5.2 μL补足20.0 μL。优化后的反应程序如下：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，45个循环。

2.2 RT-qPCR标准曲线 紫外吸收法测定重组质粒pMD18-PTV质量浓度为144 ng/μL，经计算拷贝数为4.6×1010拷贝/μL。以10倍系列稀释的标准pMD18-PTV重组质粒(4.6×108～4.6×102拷贝/μL)为模板进行TaqMan实时荧光定量PCR反应，荧光定量PCR在4.6×108～4.6×102拷贝/μL具有良好的线性关系(图1)。根据检测结果所计算出的标准曲线见图2，曲线相关系数为0.996，斜率为-3.201，截距为40.527，从而可以得出拷贝数(X)与Ct值之间的线性关系表达式为：Ct=-3.201×logX+40.527。根据被检样本产生的Ct值代入上述表达式即可计算出初始拷贝数。

图1 质粒模板标准品10倍倍比稀释RT-qPCR扩增曲线Fig.1 Detection results of the recombinant plasmid pMD18-PTV with 10 fold serial dilution by the RT-qPCR assay1～8：重组质粒模板浓度分别是4.6×109、4.6×108、4.6×107、4.6×106、4.6×105、4.6×104、4.6×103拷贝/μL和4.6×102拷贝/μL； 9：ddH2O1～8: RT-qPCR results of the recombinant plasmid pMD18-PTV concentrations of 4.6×109，4.6×108，4.6×107，4.6×106，4.6×105，4.6×104，4.6×103 copies/μL and 4.6×102 copies/μL,respectively； 9:ddH2O

图2 PTV RT-qPCR 标准曲线的建立Fig.2 Establishment of the standard curve with recombinant plasmid

2.3 敏感性试验 用建立的PTV一步法RT-qPCR检测方法对4.6×109～4.6×100拷贝/μL的标准质粒pMD18-PTV进行敏感性试验。结果显示，该方法的最低检下限为4.6×101拷贝/μL的质粒模板(图3)。

图3 RT-qPCR敏感性试验结果Fig.3 The sensitivity test results of RT-qPCR1～10：重组质粒模板浓度分别是4.6×109、4.6×108、4.6×107、4.6×106、4.6×105、4.6×104、4.6×103、4.6×102、4.6×101拷贝/μL和4.6×100拷贝/μL； 11：ddH2O1～10: RT-qPCR results of the recombinant plasmid pMD18-PTV concentrations of 4.6×109，4.6×108，4.6×107，4.6×106，4.6×105，4.6×104，4.6×103，4.6×102，4.6×101 copies/μL and 4.6×100 copies/μL,respectively； 11:ddH2O

2.4 特异性试验 利用建立的RT-qPCR检测PTV及其他几种相关的猪疫病病毒，仅PTV呈阳性，出现特异性荧光扩增曲线，PDCoV、PEDV、TGEV、PRoVA、PKV、PRV、CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV及阴性对照均为阴性，表明该方法具有良好的特异性(图4)。

图4 RT-qPCR特异性试验结果Fig.4 Specificity test results of RT-qPCR1: PTV阳性对照； 2～11: PEDV，TGEV，PDCoV，PRoVA，PKV，PRV，CSFV，PRRSV，PCV-2，PPV； 12：ddH2O阴性对照1: PTV positive control; 2～11: PEDV,TGEV,PDCoV,PRoVA,PKV,PRV,CSFV,PRRSV,PCV-2,PPV; 12: ddH2O negative control

2.5 RT-qPCR重复性分析 将建立的RT-qPCR检测方法进行重复性试验。分别以4.6×102、4.6×104、4.6×106拷贝/μL的低、中、高浓度的标准质粒pMD18-PTV作为模板，进行3次组内与组间RT-qPCR反应扩增。结果显示，同一模板浓度的Ct值都很稳定，组内与组间的3次重复的变异系数(CV)均小于4%(表2)，说明具有良好的稳定性和可重复性。

表2 RT-qPCR重复性试验结果Table 2 Repeatability test results of the RT-qPCR

2.6 临床样品的检测 取2018年3月—2019年4月从广西不同规模猪场收集的235份腹泻病料，对本试验建立的一步法RT-qPCR方法开展应用检测。结果显示，广西腹泻病例样品中PTV的阳性率为13.62%(32/235)，比本实验室先前建立的普通RT-PCR方法检出率10.21%(24/235)稍高。普通RT-PCR方法检测阳性的24份 样品，RT-qPCR方法检测为阳性且Ct值较小(15～27)；而用本试验建立的RT-qPCR方法从普通RT-PCR方法检测阴性的211份样品筛查到8份为PTV阳性，但是它们的Ct值较大(30～35)。

3 讨论

PTV最早发现于捷克斯洛伐克，1930—1950年间，欧洲有数千例PTV-1毒株引起的猪脑脊髓灰质炎暴发，使养猪业蒙受巨大的经济损失。随后其毒力逐渐改变，表现为脑脊髓炎的病例明显减少，高致病性的毒株被弱毒株所取代[18]。目前，PTV有至少13个血清型，通常大多数毒株是引起无明显临床症状的隐性感染，但一些毒株感染可引起诸如脑脊髓炎、肺炎、肠炎及繁殖障碍等一系列相关病症的疾病。

健康猪群中PTV亚临床感染较为普遍[19]，可从无明显临床症状猪只的粪便乃至内脏器官中检测到或者分离到该病毒，虽然病毒的毒力不强，但往往成为不被重视的传染源，造成的危害亦不容忽视。

近些年来，对PEDV、TGEV和PDCoV的研究报道相对较多，而对PTV在引起腹泻中扮演什么样的角色仍然知之甚少。迄今已有多个血清型的PTV毒株相继从发病猪的肠道或者内脏器官中分离出来，动物试验亦证实这些PTV毒株可以引起猪只出现包括腹泻在内的症状及相关的病理变化[10,12,20]。从攻毒猪的临床表现及肠道病理变化来说，PTV与PEDV、TGEV、PDCoV引起的临床症状表现极为相似，仅靠眼观根本无法确定究竟是哪种病毒感染引起的腹泻，因此需借助实验室诊断来确定病原。针对PTV的检测方法包括传统的病毒分离、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组化(IHC)等方法。病毒分离可靠，但耗时费力；免疫学试验虽然敏感，但容易出现交叉反应。分子生物学检测方法，尤其是荧光定量PCR方法，具有特异性强、耗时短等优点。

荧光定量PCR技术于1996年由美国应用生物技术公司推出。实时荧光定量PCR是在荧光PCR基础上的技术革新，其通过荧光信号检测PCR产物，每一次PCR循环结束时收集一次荧光信号值，建立实时扩增曲线，精准地确定实时荧光定量PCR的Ct值，进而依据Ct值确定起始DNA模板拷贝数，真正做到DNA定量[21]。实时荧光定量PCR根据其原理及方法可以分为TaqMan探针、SYBR GreenⅠ荧光染料、分子信标和杂交探针等[22-23]。其中TaqMan探针法实时荧光定量PCR是高度特异的定量PCR技术，采用了引物和探针的“双重保险”，探针与2条特异性引物扩增出来的目标DNA互补结合，并利用Taq酶的5′→3′外切核酸酶活性，探针被切断后荧光报告基团产生荧光信号，荧光信号的强弱就代表了模板的数量。实时荧光定量PCR比普通PCR具有更快速、便捷、特异、敏感以及定量检测的特性，已广泛用于人和动物各种疫病的临床检测。

本试验建立的检测PTV的RT-qPCR方法，具有良好的特异性，与常见的猪肠道致病病毒均无交叉反应。应用所建立的方法对采自广西各地的235份腹泻样品进行检测，PTV的阳性检出率为13.62%，表明广西部分猪场普遍存在PTV感染，应重视并加强对该病监测及综合防控；同时该方法比本实验室先前建立的普通RT-PCR方法10.21%的检出率高，说明该方法比普通PCR的敏感度更高。总之，本试验所建立的RT-qPCR方法为PTV的检测和病毒研究分析提供了一种快速、敏感和特异的技术手段，为进一步做好广西PTD的检测监测、预警及防控提供了有力支撑。