TNF-α 促进乳腺癌细胞的干性及分子机制

张静，李罡，张欣，刘艳翠，郑晓宇，孙平

1.牡丹江医学院解剖教研室，黑龙江牡丹江 157011；2.牡丹江医学院附属红旗医院骨外一科，黑龙江牡丹江 157011；3.牡丹江医学院附属第二医院超声科，黑龙江牡丹江 157011；4.牡丹江医学院2017 级影像9 班，黑龙江牡丹江 157011

2003 年，Al-Hajj 首次将人乳腺癌干细胞从乳腺癌组织中分离并鉴定出来[1]，从此很多相关医学研究均表明[2-4]，在乳腺癌的发生发展及复发转移中， 乳腺癌干细胞均发挥着极为重要的作用。 但是，目前，临床还没有弄清楚乳腺癌干细胞的调控机制。 该研究探讨了2019 年1—6 月TNF-α 促进乳腺癌细胞的干性及和分子机制， 现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

应用美国Hyclone 公司生产的RPMI-1640 培养基、DMEM 高糖培养基， 美国Gibco 公司生产的Opti-MEM、Gibco 血清，中国启动子生物有限公司生产的胰酶粉、NP-40 裂解液， 美国Invitrogen 公司生产的Lipo2000， 美国Sigma 公司生产的十二烷基硫酸钠（SDS）、Tris Base、甘氨酸；细胞株及质粒为T47D 细胞株、MCF-7 细胞株，分别隶属于人乳腺癌细胞系， 同时应用上海GENEPHARMA 公司生产的siNC、siEZH2；采用苏州净化设备公司生产的超净工作台， 美国Thermo 公司生产的37℃、5%CO2细胞培养箱， 德国Sigma 公司生产的台式离心机、4℃高速离心机，青岛Haier 公司生产的-40℃低温冰箱、-80℃超低温冰箱等。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 ①细胞复苏。 将冻存管从-80℃冰箱中取出，以较快的速度在37℃水浴锅中放置，尽可能快地融化，然后进行5 min 的低速离心， 将速率设定为1 200 r/min，第3 天在倒置显微镜下对细胞存活率进行观察并换液；②细胞传代培养（贴壁细胞）。 将旧培养液吸掉，用PBS 对细胞进行1 次洗涤， 将1.0 mL 0.25%胰蛋白酶加入，在

37℃培养箱中进行15 s～30 min 的作用后在等量含血清的培养基中加入， 将消化作用终止。 用吸管对细胞进行吹打，尽可能吹打其为单细胞悬液，将其中1/3 取出来，向新的培养瓶中转移培养， 将培养基补足后在细胞培养箱中放置继续培养；③细胞冻存。 在细胞具有良好的状态的情况下冻存细胞，用胰酶消化贴壁细胞后对细胞进行吹打，对其成团的现象进行有效避免，进行5 min 的离心，将速率设定为1 000 r/min，将上清液吸掉。 将1 mL 细胞冻存液加入，标记好。 用封口膜封口。 在4℃、-20℃、-80℃的温度下分别冷冻30 min、2 h、24 h，长期储存在液氮罐中。

1.2.2 脂质体（Lipofectamine2000）转染细胞 用胰酶对细胞进行消化，将消化终止后离心将培养液弃去，在六孔板中均匀接种3～5×105个细胞，对细胞密度进行观察，其达到60%左右后转染。 将2 个无菌EP 管准备出来，体积为1.5 mL， 将100 μL 无血清培养基加入到每个EP 管中，将6 μL 脂质体Lipofectamin2000 加入其中一管中，将适量需要转染的质粒加入到另外一管中，标记好，以轻柔的动作混匀，室温下进行5 min 的放置。在一个EP 管中加入另一个EP 管中的液体，以轻柔的动作混匀，进行20 min 的放置。 吸掉六孔板中的培养基，将PBS 加入对细胞进行1 次冲洗，将2.0 mL 无血清培养基加入，在六孔板中加入混合液，标记好，在细胞培养箱中放置培养。 4～6 h 后吸掉无血清培养基，将PBS 加入对细胞进行1 次冲洗，将2 mL 含10%胎牛血清的培养基加入，继续进行1～2 d 左右的培养后将细胞收起来。

1.2.3 肿瘤干细胞微球体形成实验 用DMEM/F12 培养基将干细胞培养基配制出来，将4 mg/mL BSA+100 μg/mL A po-transferin+25 μg/mL Insulin+9.6 μg/mL Putrescin+4 μg/mL Heparin+10 μg/mL bFGF+20 μg/mL EGF 加入。 用1×PBS 对消化终止后的细胞进行2 次洗涤，稀释成单细胞悬液后在Corning 公司生产的低吸附六孔板中接种， 每孔1 000 个细胞， 进行2 周的培养后对细胞球体个数进行计数，对细胞球体大小进行测量。

1.2.4 CD44+/CD24- 干细胞群流式细胞术检测 培养细胞到对数生长期， 将0.25%胰蛋白酶加入对细胞进行消化，待其从培养皿壁上脱落后将培养基加入将消化终止。 进行5 min 的离心， 将速率设定为1 200 r/min， 将预冷的PBS 加入进行2 次洗涤，平均分每管细胞为4 份，离心。将PBS 去掉， 将空白对照设定为其中1 管， 将PE-CD24 抗体、APC-CD44 抗体、PE-CD24 抗体+APC-CD44 抗体分别加入另外3 管， 室温下进行1 h 的避光孵育。 用预冷的PBS 进行2 次洗涤，最后将200 μL PBS 加入，以轻柔的动作混匀后上机检测。

1.2.5 Western blot 提取细胞总蛋白，运用BCA 法对蛋白浓度进行测定，制胶，上样、电泳、转膜，封闭，曝光，洗脱。

1.2.6 EZH2 mRNA 表达水平Real-Time PCR 检 测 运用Trizol 法将细胞内总RNA 提取出来， 向cDNA 逆转录，Real-Time PCR，Primer 引物依据GenBank 将人GAPDH碱基序列、EZH2 基因获取过来，采用Primer 5.0 软件对引物进行设计，GAPDH、EZH2 上游引物分别为5’-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3’、5’-AATCAGAGTACATGCGACTGAGA-3’，下游引物分别为5’-AGTCTTCTGGGT GGCAGTGAT -3’、5’ -GCTGTATCCTTCGCTGTTTCC -3’。反应体系为10 μL 2×SYBR Green+1 μL cDNA+2 μL 上有引物（10 μM）+2 μL 下游引物（10 μM）+5 μlLddH2O=20 μl/管，在ABI7300 反应系统中放置样品，在95℃的温度下进行20 s 的预变性， 在94℃的温度下进行3 s 的变性，在60℃的温度下进行30 s 的退火、延伸，共40 个循环。 对反应结果进行分析， 依据Ct 值将各组对样品中目的基因进行相对定量计算出来。

1.3 统计方法

应用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析, 计量资料用（x±s）表示,组间比较行t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌细胞干细胞（CD44+/CD24-）比例受到TNFα 的影响

TNF-α 刺激组T47D 细胞、MCF-7 细胞分别为（3.86±0.64）%、（14.56±1.74）%， 空白对照组T47D 细胞、MCF-7细胞分别为（0.46±0.10）%、（9.46±1.80）%。 TNF-α 刺激组患者的T47D 细胞、MCF-7 细胞干细胞比例均显著高于空白对照组（t=4.303、6.965，P＜0.05）。 见表1。

表1 乳腺癌细胞干细胞（CD44+/CD24-）比例受到TNF-α 的影响[（x±s），%]Table 1 The proportion of breast cancer cell stem cells (CD44+/CD24-) affected by TNF-α[（x±s），%]

2.2 乳腺癌细胞中EZH2 mRNA 水平受到TNF-α 的影响

TNF-α 刺激组患者的T47D 细胞、MCF-7 细胞EZH2 mRNA 水 平 均 显 著 高 于 空 白 对 照 组 （t=3.182,2.776，P＜0.05）。 见表2。

表2 乳腺癌细胞中EZH2 mRNA 水平受到TNF-α 的影响（x±s）Table 2 EZH2 mRNA levels in breast cancer cells affected by TNF-α(x±s)

2.3 EZH2 表达下调后乳腺癌细胞成球能力受到TNFα 的影响

TNF-α+siNC 组、Untreated 组 患 者 的T47D 细 胞、MCF-7 细胞成球能力均显著高于TNF-α+siEZH2 组 （P＜0.05）， 而Untreated 组 患 者 的 成 球 能 力 又 均 显 著 高 于TNF-α+siEZH2 组（P＜0.05）。 见表3。

表3 EZH2 表达下调后乳腺癌细胞成球能力受到TNF-α 的影响（x±s）Table 3 The ability of breast cancer cells to become globular after down-regulation of EZH2 affected by TNF-α (x±s)

2.4 EZH2 表达下调后乳腺癌细胞中干细胞比例受到TNF-α 的影响

TNF-α+siNC 组、Untreated 组 患 者 的T47D 细 胞、MCF-7 细胞CD44+/CD24-细胞比例均显著高于TNF-α+siEZH2 组 （P ＜0.05）， 而Untreated 组 患 者 的CD44+/CD24-细胞比例又均显著高于TNF-α+siEZH2 组 （P＜0.05）。 见表4。

表4 EZH2 表达下调后乳腺癌细胞中干细胞比例受到TNF-α 的影响[（x±s），%]Table 4 The proportion of stem cells in breast cancer cells after down-regulation of EZH2 affected by TNF-α[（x±s），%]

3 讨论

乳腺是由皮肤，纤维组织，腺体和脂肪组成的。 乳腺癌是指发生在乳腺腺上皮组织上的恶性肿瘤，99%的乳腺癌发生在女性，男性约占1%。 近年来，我国乳腺癌的发病率呈上升趋势。 乳腺癌的病因尚未完全清楚，它的危险因素有乳腺癌家族史、月经初潮早或者绝经晚、未婚未育及晚育、长期饮酒、肥胖等。 症状方面，乳腺癌主要表现为乳房肿块，乳头下陷，乳头溢液，一般为血性溢液，以及皮肤的改变，最常见的是橘皮样改变。 另外，晚期的乳腺癌可以出现腋窝淋巴结转移以及肺部、骨、脑及肝脏等远处的转移。 乳腺癌的患者可在乳腺处可摸到包块，并且位置比较深，表面不光滑，质地较硬，活动度不是特别好。 其次乳头凹陷，也是乳腺癌代表性的特点。 另外乳头溢液、溢血液或黄色的液体、 乳腺的皮肤出现橘皮样的改变也都是乳腺癌的症状。 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，乳腺是由皮肤、纤维组织、乳腺腺体和脂肪组成的。 目前乳腺癌的治疗比较规范，属于综合性的治疗，应当根据肿瘤的分期和患者的身体状况，酌情采用手术治疗、化疗、放疗、内分泌治疗，还有基因靶向治疗及中医药辅助治疗等多种手段，首选是手术治疗。 TNF-α 是肿瘤坏死因子，它可以促进T 细胞产生各种炎症因子， 进而促进炎症反应的发生。

相关医学研究表明[5]，肿瘤干细胞和炎性肿瘤微环境的关系极为密切。 在肿瘤微环境炎症因子中，TNF-α 占有重要地位，其分泌主体为巨噬细胞。 很多相关医学研究均表明[6-8]，TNF-α 对肿瘤进展中很多重要过程进行介导。 在TNF-α 下游信号通路中，AKT 信号占有重要地位，其在细胞凋亡、分化等中参与，能够将EZH2 的表达激活，对结肠癌上皮细胞进行诱导，促进上皮间质转化（EMT）的发生。同时， 还能够对凋亡过程中的关键调控因子进行直接磷酸化，对凋亡进行抵抗[9]。 张国强等[10]相关医学研究表明，TNF-α 能够促进乳腺癌细胞自我更新能力的增强， 途径为 将AKT 信 号 通 路 活 化， 将EZH2 表 达 上 调 [（5.20±1.35）%→（8.12±1.63）%]。 该研究结果表明， TNF-α 刺激组T47D 细胞、MCF-7 细胞分别为 （3.86±0.64）%、（14.56±1.74）%， 空 白 对 照 组T47D 细 胞、MCF-7 细 胞 分 别 为（0.46±0.10）%、（9.46±1.80）%。 TNF-α 刺激组患者的T47D细胞、MCF-7 细胞干细胞比例均显著高于空白对照组（t=4.303、6.965，P＜0.05）。 TNF-α 刺激组患者的T47D 细胞、MCF-7 细胞EZH2 mRNA 水平均显著高于空白对照组（t=3.182、2.776，P＜0.05）。TNF-α+siNC 组、Untreated 组患者的T47D 细胞、MCF-7 细胞成球能力均显著高于TNF-α+siEZH2 组（P＜0.05），而Untreated 组患者的成球能力又均显著高于TNF-α+siEZH2 组 （P＜0.05）。 TNF-α+siNC 组、Untreated 组 患 者 的T47D 细 胞、MCF-7 细 胞CD44+/CD24-细胞比例均显著高于TNF-α+siEZH2 组（P＜0.05），而Untreated 组患者的CD44+/CD24-细胞比例又均显著高于TNF-α+siEZH2 组（P＜0.05），和上述相关医学研究结果一致。

综上所述，TNF-α 通过将AKT 信号通路活化，将EZH2 表达上调，促进乳腺癌细胞自我更新能力的增强。