不同品种谷子愈伤组织对拿捕净胁迫的生理响应

2020-03-30赵娟尹艺臻王晓璐马春英尹美强温银元宋喜娥董淑琦杨雪芳原向阳

中国农业科学 2020年5期

赵娟，尹艺臻，王晓璐，马春英，尹美强，温银元，宋喜娥，董淑琦，杨雪芳，原向阳

（山西农业大学农学院，山西太谷 030801）

0 引言

【研究意义】谷子（Setaria italicaBeauv.）为一年生禾本科狗尾草属植物，是中国北方干旱和半干旱地区重要的区域性粮食作物，具有抗旱、耐瘠、水分利用效率高、营养丰富等特点，在中国的粮食安全中起重要作用[1-4]。脱壳后的谷子称为小米，含丰富的蛋白质、维生素、脂肪、钙铁锌硒等微量元素，是中国传统作物和环境友好型作物[5-7]。谷田杂草种类繁多，危害严重，导致养分流失，植株生长矮小，减产可达20%以上，严重制约谷子生产，田间除草已成为阻碍谷子大面积推广生产的重要因素之一[8-9]。目前，使用除草剂仍然是解决田间杂草危害的有效途径，但如果施用不当就会产生严重药害。因此，开展谷子除草剂抗性研究，了解谷子抗除草剂生理机理，对开展谷子抗除草剂相关研究和抗性品种筛选具有重要意义。【前人研究进展】温银元等[10]研究扑草净对远志（Polygala tenuifoliaWilld.）幼苗生长、根系活力、膜脂过氧化、活性氧含量及抗氧化酶活性等的影响，表明远志幼苗可通过多种抗氧化酶（SOD、POD、CAT、APX等）和非酶抗氧化剂（如脯氨酸）的相互协调作用，清除低浓度扑草净胁迫诱发产生的活性氧，减轻对细胞的伤害。吴燕等[11]研究滁菊（Dendranthema morifoliumL.）幼苗对除草剂乙草胺的生理响应，表明乙草胺处理降低了滁菊叶片抗氧化酶SOD、POD和CAT活性，叶片相对电导率和MDA含量增加，严重破坏细胞膜结构。孙昊等[12]用8种除草剂处理中华水韭（Isoetes sinensisPalmer）后发现其叶片叶绿素含量显著降低，气孔导度和蒸腾速率急剧升高，净光合速率明显降低。除草剂在谷子上的相关研究表明，除草剂胁迫对谷子生长发育、产量形成、生理生态等方面均有较大影响[13-17]。除草剂胁迫影响谷子种子萌发，导致谷子生长速率减缓，生物量降低，严重影响谷子的生长发育。高爱保等[18]比较研究了拿捕净（烯禾啶）对6个不同品种谷子的影响，发现胁迫后抗性品种叶绿素含量较高，且抗性品种抗氧化酶活性较强。杨慧杰等[19]研究表明除草剂阔世玛对谷子产生显著药害,油菜素内酯可以通过提高光合色素含量、增加气孔导度、提高PSⅡ光化学活性等来缓解阔世玛对谷子光合作用的抑制。【本研究切入点】近年来，植物组织培养技术在抗除草剂作物的培育方面发展较快[20-24]。离体培养获得的愈伤组织对除草剂十分敏感，容易产生突变体，筛选获得的突变体再生成植株得到抗性新品种。通过离体筛选，已经成功培育了烟草、小麦、玉米、大豆、棉花、高粱等多种作物的抗除草剂品种，但在谷子上进展缓慢[25]。主要原因是逆境条件下植物的响应机制复杂，对谷子在除草剂胁迫下的相关研究主要集中在大田植株上，从细胞水平对其生理响应和抗性机理进行研究的报道较少，且不同感抗性谷子愈伤组织对除草剂胁迫的生理响应差异的研究更是鲜见报道。【拟解决的关键问题】本研究选用对拿捕净有不同抗性的3个谷子品种愈伤组织为材料，在离体培养的条件下对其进行不同浓度的拿捕净胁迫处理，测定谷子愈伤组织细胞中的MDA、O2-含量和膜透性、渗透调节物质（SP、Pro、SS）含量和抗氧化酶系（SOD、POD、CAT）活性，分析对拿捕净感抗性差异显著的3个谷子品种的响应机理差异，从细胞水平对谷子抗除草剂的生理响应进行初步研究，为深入研究谷子除草剂抗性机制和抗除草剂品种的离体筛选提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用拿捕净敏感品种晋谷21号和拿捕净抗性品种豫谷35号、冀谷42号为试验材料。除草剂拿捕净（中农立华农用化学品有限公司），有效成分含量为12.5%。

1.2 试验方法

1.2.1 愈伤组织的诱导以前期试验筛选出的适宜培养基MS+2.0 mg·L-12,4-D+0.2 mg·L-16-BA为基本培养基，将经过灭菌处理的3种谷子种子接种到愈伤组织诱导培养基上，每处理接种70粒种子，在（25±1）℃黑暗中培养3周，诱导获得愈伤组织。

1.2.2 拿捕净胁迫处理选择生长旺盛、均匀一致的愈伤组织分别接种到以MS+2.0 mg·L-12,4-D+0.2 mg·L-16-BA为基本培养基，添加不同浓度拿捕净（0、0.5、1、2和3 mL·L-1）的培养基上，以不添加拿捕净的处理为对照，暗培养2 d后测定不同处理下3种愈伤组织的MDA含量、SOD活性、SP含量等各项生理指标，试验重复3次。培养至2周后，观察比较不同浓度拿捕净胁迫对3种谷子愈伤组织生长的影响。

1.2.3 生理指标的测定采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量；采用电导仪法测定细胞膜相对透性；采用羟胺氧化法测定超氧阴离子（O2-）含量；采用NBT光化学还原法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用愈创木酚比色法测定过氧化物酶（POD）活性；采用紫外吸收法测定过氧化氢酶（CAT）活性；采用考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白（SP）含量；采用蒽酮比色法测定可溶性糖（SS）含量；采用酸性茚三酮法测定脯氨酸（Pro）含量。

1.3 数据分析

采用Excel 2013软件对数据进行统计并制图，用SPSS 19.0对数据进行多重比较和方差分析。

2 结果

2.1 拿捕净胁迫对3种谷子愈伤组织生长的影响

不同浓度拿捕净胁迫对3个谷子品种愈伤组织生长的影响不同，对晋谷21的影响要明显大于豫谷35和冀谷42。在附加不同浓度拿捕净的培养基中，晋谷21的愈伤组织生长明显受抑，出现褐化皱缩现象，且随处理浓度升高，褐化皱缩明显（图1-d1和图1-e1）。豫谷35的愈伤组织在附加低浓度拿捕净的培养基上褐化不明显，并可继续生长增殖，胁迫浓度达到3 mL·L-1时，出现较明显褐化（图1-e2）。冀谷42的愈伤组织在附加不同浓度拿捕净的培养基上均可持续生长增殖，处理浓度达到3 mL·L-1时，出现轻微褐化（图1-e3）。

图1 不同浓度拿捕净对谷子愈伤组织生长的影响Fig.1 Effect of different concentrations of Sethoxydim on growth of millet callus

2.2 拿捕净胁迫对谷子愈伤组织MDA、膜透性和O2-含量的影响

2.2.1 丙二醛（MDA）含量提高拿捕净处理浓度，3种谷子愈伤组织中MDA含量变化趋势略有不同（图2-A）。处理浓度超过0.5 mL·L-1后，随浓度增加，晋谷21和冀谷42的愈伤组织中MDA含量均不断增加，二者差异不显著，处理浓度达3 mL·L-1时，冀谷42愈伤组织中MDA含量低于晋谷21；豫谷35的愈伤组织中MDA含量则先降低后升高，且在每个处理浓度均显著低于晋谷21号。

2.2.2 细胞膜相对透性拿捕净处理浓度低于1 mL·L-1时，随着拿捕净处理浓度升高，3种谷子愈伤组织细胞膜相对透性与对照相比均出现上下波动，但变化不明显；胁迫浓度达到2 mL·L-1时，3种谷子的膜透性均快速上升，以冀谷42上升幅度明显低于前两者；胁迫浓度达到3 mL·L-1时，晋谷21和冀谷42膜透性继续增加，而豫谷35则明显降低，三者差异显著（图2-B）。

2.2.3 O2-含量不同浓度拿捕净处理对3种谷子愈伤组织中O2-含量的影响不同（图2-C）。晋谷21和豫谷35的O2-含量均随着拿捕净浓度的增加呈现先降低后升高的趋势，但处理浓度高于0.5 mL·L-1后，豫谷35的O2-含量始终显著低于晋谷21；冀谷42的O2-含量随着拿捕净浓度的增加则呈现先增高后降低的趋势，处理浓度为2 mL·L-1时达到峰值，处理浓度为3 mL·L-1时，O2-含量快速降低，显著低于晋谷21号。

图2 拿捕净胁迫对谷子愈伤组织中MDA含量、膜透性、O2-含量的影响Fig.2 Effects of sethoxydim stress on the content of MDA,membrane permeability, O2- in millet callus

2.3 拿捕净胁迫对谷子愈伤组织细胞中抗氧酶活性的影响

2.3.1 超氧化歧化酶（SOD）活性随拿捕净处理浓度增加，晋谷21和豫谷35愈伤组织中SOD活性均呈先升高后降低的趋势（图3-A），均在胁迫浓度为1 mL·L-1时达到最大值，之后活力大幅降低，但豫谷35的SOD活性始终显著高于晋谷21号；而冀谷42的SOD活性则随着拿捕净处理浓度的增高呈先降低后升高再降低的趋势，处理浓度为2—3 mL·L-1时，其SOD活性与豫谷35接近，且显著高于晋谷21号。

2.3.2 过氧化物酶（POD）活性由图3-B可见，3种谷子愈伤组织中POD活性变化趋势不同。晋谷21号的POD活性随着拿捕净浓度的增高呈现先增高后降低的趋势；豫谷35的POD活性则随着拿捕净处理浓度的增加先降低后持续上升；冀谷42的POD活性在处理浓度为1 mL·L-1时达到峰值，显著高于其他2个品种。虽然豫谷35和冀谷42的POD活性变化趋势不同，但在拿捕净各浓度胁迫下，二者的POD活性均显著高于晋谷21，且差异显著。

2.3.3 过氧化氢酶（CAT）活性随着拿捕净处理浓度的提高，晋谷21愈伤组织中CAT活性先降低后升高，在处理浓度为3 mL·L-1时达到峰值，且显著高于豫谷35和冀谷42（图3-C）。处理浓度低于3 mL·L-1时，豫谷35和冀谷42 CAT活性虽有上下波动，但始终高于晋谷21，尤其是冀谷42，在处理浓度为2 mL·L-1时达到峰值，且活性显著高于晋谷21号。

图3 拿捕净胁迫对谷子愈伤组织中SOD、POD、CAT活性的影响Fig.3 Effects of sethoxydim stress on SOD, POD, CAT activity in millet callus

2.4 拿捕净胁迫对谷子愈伤组织可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量的影响

2.4.1 可溶性蛋白（SP）含量不同浓度的拿捕净处理对3种谷子愈伤组织中SP含量的影响不同（图4-A）。晋谷21的SP含量随着拿捕净处理浓度的增高呈现先增高后降低的趋势，当拿捕净浓度为2 mL·L-1时，SP含量达到最高，随后快速下降；冀谷42的SP含量随着拿捕净浓度的增高变化不显著，在较高胁迫浓度时略有下降；而豫谷35的SP含量随着拿捕净浓度的增高持续上升，虽然达到最大值时的绝对含量仍低于晋谷21号，但与其对照相比，增幅显著。

2.4.2 可溶性糖（SS）含量不同浓度的拿捕净处理对3种谷子愈伤组织中SS含量的影响不同（图4-B）。晋谷21的SS含量随着拿捕净处理浓度的增高呈现先增高后降低的趋势，当拿捕净浓度为1 mL·L-1时，SS含量达到最高，之后含量持续降低；而豫谷35和冀谷42的SS含量随着拿捕净浓度的增高呈现先降低再增高再降低的波动趋势，拿捕净浓度低于2 mL·L-1时，SS含量均显著低于晋谷21号，拿捕净浓度大于1 mL·L-1后，冀谷42的SS含量则明显高于晋谷21号。

2.4.3 脯氨酸（Pro）含量由图4-C可见，拿捕净处理浓度为0.5 mL·L-1时，豫谷35愈伤组织中Pro含量显著降低，在其他处理浓度下，豫谷35和晋谷21的变化趋势和Pro含量接近，差异不大。而冀谷42愈伤组织中虽然Pro绝对含量低于前两者，但与对照相比，随拿捕净处理浓度增加，Pro含量持续大幅增加。

图4 拿捕净胁迫对谷子愈伤组织中可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸含量的影响Fig.4 Effects of sethoxydim stress on the content of soluble protein, soluble sugar,proline in millet callus

2.5 各项生理指标相关性分析

2.5.1 3个品种不同生理指标间的相关分析分析比较3个品种谷子愈伤组织在拿捕净胁迫下所测定的各生理指标之间的相关性可知，试验中所测定的各项生理指标相关性在3个品种间有较大的差异（表1—表3）。晋谷21号的CAT和SOD活性呈极显著负相关，豫谷35号的CAT和SOD活性呈显著正相关，冀谷42号的CAT和SOD活性呈极显著正相关。晋谷21号的SOD活性与O2-含量呈极显著的负相关（r=0.655），豫谷35号的SOD活性与O2-含量呈极显著的负相关（r=0.973），且豫谷35号SOD的活性明显高于晋谷21号的活性，这与晋谷21和豫谷35活性变化趋势一致。豫谷35号的可溶性蛋白含量与其他指标大多呈显著性或极显著相关，而晋谷21号以及冀谷42号的可溶性蛋白含量与其他8个指标相关性均不显著，这也表现出3个品种对拿捕净胁迫的响应机制不同。

2.5.2 不同品种间各生理指标的相关分析对所测得的9个生理生化指标，3个品种间两两进行相关性分析，结果表明，所测定的各项生理指标相关性在3个品种两两之间均有明显差异（表4—表6）。晋谷21和豫谷35、冀谷42的9个测定指标之间多数成负相关，且多数指标之间的负相关性均达显著或极显著水平（表4和表5）。可见，拿捕净胁迫对晋谷21号和豫谷35、冀谷42生理生化指标的影响不尽相同。反映出3个品种在拿捕净胁迫下细胞内各种酶及渗透调节物质等作用的差异性及拿捕净抗性的不同。豫谷35号和冀谷42号的9个测定指标的相关系数在0.006—0.880，2个品种谷子之间的O2-含量和可溶性蛋白含量呈负相关，反映出2个抗性品种对拿捕净胁迫的响应过程也不完全一致。

表1 晋谷21号谷子种子愈伤组织各项生理指标的相关分析Table 1 Correlation analysis of various physiological indexes of millet seed callus in Jingu 21

表2 豫谷35号谷子种子愈伤组织各项生理指标的相关分析Table 2 Correlation analysis of various physiological indexes of millet seed callus in Yugu 35

表3 冀谷42号谷子种子愈伤组织各项生理指标的相关分析Table 3 Correlation analysis of various physiological indexes of millet seed callus in Jigu 42

表4 拿捕净胁迫下晋谷21号和豫谷35号生理生化指标的相关分析Table 4 Correlation analysis of various physiological indexes of millet seeds callus in Jingu 21 and Yugu 35

表5 拿捕净胁迫下晋谷21号和冀谷42号生理生化指标的相关分析Table 5 Correlation analysis of various physiological indexes of millet seeds callus in Jingu 21 and Jigu 42

3 讨论

3.1 除草剂拿捕净胁迫对谷子愈伤组织的生理伤害

植物在受到各种逆境胁迫后，细胞中会产生大量活性氧，打破正常生长条件下植物体内活性氧的产生和消除之间的动态平衡，导致植物细胞膜脂过氧化产生丙二醛（MDA），同时导致膜结构被破坏，膜透性增强。因此，MDA含量及细胞膜相对透性是植物逆境胁迫下膜系统受伤害程度的重要指标[26]。本研究供试的3个谷子品种愈伤组织在拿捕净胁迫下，MDA和O2-含量均随胁迫浓度的增加而不断增加，这与现有研究结果一致[27-29]。说明，适宜浓度除草剂处理对谷子的生理伤害较小，提高拿捕净浓度则导致谷子愈伤组织细胞内活性氧增加，引起细胞膜脂过氧化，造成MDA积累，并破坏膜结构，伤害细胞。

3.2 除草剂拿捕净胁迫下谷子生理生化响应差异

MDA是膜脂过氧化的重要产物，其含量的变化反应膜脂过氧化的程度，细胞膜相对透性反应膜受伤害的程度，二者与植物的抗逆性呈负相关[28-29]。本研究发现随着拿捕净浓度的增高，3种谷子愈伤组织中MDA含量均呈现先降低后增高的趋势，这与叶亚新等[30]研究除草剂胁迫下萝卜幼苗内MDA含量先增高后降低的趋势不同，可能与不同植物有关。当拿捕净浓度较低时，3种愈伤组织中MDA含量都有所降低，且在3个品种间差异不显著，这说明低浓度的拿捕净处理对愈伤组织细胞膜影响不大；提高拿捕净处理浓度时，MDA、O2-含量随之增高，膜透性增强，说明膜脂过氧化加剧，细胞膜出现明显损伤，但豫谷35和冀谷42的MDA含量增长幅度明显小于晋谷21号，这与SOD和POD活性的变化相协调。

植物体内存在一个多种抗氧化酶相互协调作用的防御体系抑制活性氧对细胞产生的伤害，SOD、POD和CAT是其中重要的保护酶，它们活性的高低与植物的抗逆性有关[31-33]。本研究发现晋谷21号随着拿捕净浓度的增高SOD和POD活性均呈现出先增高后降低的趋势，这与申建芳等[32]研究发现燕麦在除草剂胁迫下SOD和POD的变化趋势一致，说明愈伤组织对拿捕净胁迫作出的响应，细胞内过氧化产物（O2-，H2O2）增多，保护酶活性迅速升高，以除去过氧化产物，维持愈伤组织的正常生长；而豫谷35和冀谷42愈伤组织中SOD和POD活性均随着拿捕净浓度的增高而增高，且显著高于晋谷21，这说明豫谷35和冀谷42愈伤组织的抗氧化能力强于晋谷21。3种愈伤组织中CAT活性随着拿捕净浓度的增高均呈现出先增高后降低的趋势，与SOD和POD活性趋势有所不同，这可能是由于不同谷子品种抗氧化酶体系中各指标的调节协同机制及响应时间与变化程度存在差异。

SP、SS和Pro是细胞内重要的渗透调节物质，对细胞的生物膜起到保护作用，是筛选植物抗性的指标[34-36]。研究发现，随着拿捕净浓度的增高晋谷21号愈伤组织中SP、SS和Pro含量均呈现先增高后降低的趋势，这与宋惠洁等[28]研究的结果一致，而豫谷35和冀谷42愈伤组织中SP、SS和Pro含量随着拿捕净浓度的增高均呈现出不规则的变化趋势，这说明细胞通过SP、SS和Pro的合成和降解来调控胞内渗透势的平衡。

3.3 谷子除草剂抗性的生理生化机理

本研究比较了对拿捕净有不同感抗性的3个谷子品种愈伤组织在不同浓度拿扑净胁迫下相关生理生化指标的变化。相较于敏感品种晋谷21，抗性品种豫谷35和冀谷42对拿捕净胁迫的生理响应一方面表现为受胁迫伤害程度较轻，胁迫后愈伤组织细胞中MDA和O2-积累量较敏感品种少，另一方面晋谷21受胁迫后积累更多的Pro和SP等渗透调节物质，以稳定体内渗压平衡，增强细胞保水能力，维护和调节体内的生理生化活动，降低拿捕净胁迫对自身的伤害。另外，除草剂胁迫后，抗性品种的抗氧化防御系统的响应水平高于敏感品种，其保护酶SOD、POD和CAT活性较敏感品种有明显增强，以减轻或消除除草剂胁迫造成的膜脂过氧化伤害。本试验结果对谷子抗除草剂胁迫机制研究及利用愈伤组织培养体系开展抗除草剂品种的离体筛选提供理论依据。