食用菌中尼古丁的毛细管电泳检测方法研究

时文兴 林 淼 邵 毅 金晓芬 刘海燕 赵刘旻*

（1上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海奉贤201403；2上海市设施园艺技术重点实验室，上海奉贤201403）

尼古丁又名烟碱，是存在于茄科植物的一种生物碱。尼古丁会使人上瘾或产生依赖性[1]，会增加心跳速度和升高血压并降低食欲，大剂量的尼古丁会引起呕吐以及恶心，严重时会致死。较小剂量尼古丁可短暂刺激兴奋呕吐中枢，同时对自主神经节、肾上腺髓质、前肢动作发展造成影响，降低人体颗粒细胞水平[2-3]。尼古丁急性中毒初始，出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻、出汗、流涎、心动过速、血压升高、呼吸增快、头昏、眩晕、烦躁不安、怕光、视听觉障碍等。Castro等[4]首次用放射免疫法提供可靠数据，证明茄类蔬菜如番茄、土豆中也含有尼古丁。

食用菌因其高蛋白、低脂肪、富含维生素、矿物质和膳食纤维并且风味独特逐渐受到人们关注，成为餐桌上的新宠。欧盟食品安全委员会（EFSA)调查发现，欧盟市场上99%的野生菌样品中尼古丁含量均超出其法定最高限量0.01 mg/kg，且多数来自中国。该食品安全委员迫于食用菌输出国政府、欧盟进口商和生产商组织的压力，已作出限量紧急修订，EFSA建议食用菌鲜品和干品中尼古丁最高限量分别为0.036 mg/kg和1.17 mg/kg。2009年一月份云南出口德国的牛肝菌尼古丁含量超标，虽经调查牛肝菌中的尼古丁是来自内源代谢产物而非加工污染，但这一事件还是给我国食用菌行业敲响了警钟，对食用菌中尼古丁含量的监控和检测刻不容缓。

毛细管电泳分析法[5]测定食用菌中尼古丁含量，分离效率高，测定速度快，分离与测量同步进行，重现性好，回收率高，过程无污染，越来越受到科研工作者的关注。现将其优化电泳方法介绍如下。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试剂

市售牛肝菌干品、鲜品，香菇鲜品，木耳干品。化学试剂：酒石酸（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、甲醇。尼古丁标准品购自sigma公司。标准品储备液：称取适量的尼古丁标准品，用去离子水配制成浓度为100 μg/mL的标准储备液，4℃保存，一个月为限。

尼古丁工作标准液：分别移取适量的尼古丁标准储备液用去离子水配制，浓度分别为0.005 μg/mL、0.010 μg/mL、0.050 μg/mL、0.100 μg/mL、0.500 μg/mL。

1.2 主要仪器

分析天平（精确到0.1 mg）、高速组织捣碎机（10 000 r/min～12 000 r/min）、超声波提取仪、高速离心机、毛细管电泳仪（配有紫外检测器）。石英毛细管：50 μm×60 cm，有效长度45 cm（河北永年光导纤维厂）。检测器：紫外检测器。

1.3 试验方法

1.3.1 提取条件的确定

考察提取方式、提取温度和提取时间对食用菌鲜样（牛肝菌、香菇）和食用菌干样（牛肝菌、木耳）中尼古丁测定的影响，确定了食用菌中尼古丁的最佳提取条件。

取牛肝菌、香菇鲜样和牛肝菌、木耳干样，以去离子水作为提取剂，分别采用振荡（20 min，40℃）、超声（20 min，40℃）、高速均质（1 min）方式提取。因为香菇和木耳样品中不含有尼古丁，因此对此两种样品进行了加标。香菇样品加标量为0.05 mg/kg，木耳样品加标量为1.00 mg/kg。最终确定提取方式。

取牛肝菌和木耳干样样品（木耳样品加标量为1.00 mg/kg）。以去离子水作为提取剂，采用超声提取法，不同的提取温度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃），提取时间为40 min。最终确定提取温度。

牛肝菌和香菇鲜样（香菇中加标量为0.05 mg/kg）采用高速均质的提取法，提取时间分别设为1 min、2 min和3 min和4 min；牛肝菌干样和木耳干样（木耳样品加标量为1.00 mg/kg），去离子水作为提取剂，采用60℃超声的方式进行提取。提取时间设为 10 min、15 min、20 min、25 min和 30 min。最总确定提取时间。

1.3.2 电泳参数确定

确定优化缓冲液、缓冲液pH、缓冲液浓度、电泳电压等参数。采用350 mmol/L的酒石酸缓冲溶液，用5 mol/L的氢氧化钠溶液分别调节pH为2.8、3.0、3.2、3.4、3.6，上机分析，确定pH；试验分别选取了浓度 为 320 mmol/L、335 mmol/L、350 mmol/L、365 mmol/L、380 mmol/L的缓冲溶液，以确定最佳缓冲液浓度。

1.3.3 方法性能检验

根据本试验涉及的尼古丁在常见食用菌中的含量范围，设定标准溶液的梯度浓度为0.005 μg/mL、0.010 μg/mL、0.050 μg/mL、0.100 μg/mL、0.500 μg/mL。用上述毛细管电泳条件检测并计算，获得尼古丁的线性方程。

方法准确度试验，选用3种常见的食用菌样品（香菇鲜样、牛肝菌鲜样、木耳干样、牛肝菌干样）作为基质做添加回收试验。食用菌鲜样按照0.025 mg/kg、0.05 mg/kg和0.1 mg/kg加标。食用菌干样按照0.5 mg/kg、1 mg/kg和2 mg/kg加标。

重复性试验，将牛肝菌鲜样和牛肝菌干样按优化后处理方法处理后上机检测，每个样品重复5次。以样品中尼古丁的含量测定结果计算日内变异系数，以三批测定结果计算日间变异系数。

根据公式“检出限=（W×3）/（S/N）”计算仪器检出限；根据公式“定量限=（W×10）/（S/N）”计算食用菌样品的方法定量限。式中：W为目标检测物的浓度（μg/mL）；S/N为仪器信噪比。

表1 提取方式对食用菌中尼古丁提取效果的影响

2 结果与分析

2.1 提取条件的优化确定

2.1.1 提取方式的选择

各种提取方式对食用菌样品尼古丁的提取影响见表1。结果表明，食用菌鲜样中尼古丁高速均质提取效果最好，因此鲜样采用高速均质法提取。同样的提取时间和提取温度，用超声提取食用菌干样中尼古丁效果最好，因此食用菌干样选用超声法提取。

2.1.2 提取温度的选择

高速均质方法提取鲜样中尼古丁，因均质过程中温度在逐渐升高且无法精准控制，所以只测定干样的提取温度，结果见表2。由表2可知，提取温度40℃、50℃、60℃，随着提取温度的上升，食用菌干样中尼古丁的提取量也呈上升趋势，此后尼古丁提取量未随着温度的上升而上升，因此最终确定超声提取食用菌干样中尼古丁，适宜提取温度为60℃。

表2 提取温度对食用菌干样中尼古丁提取效果的影响

2.1.3 提取时间的选择

高速均质提取食用菌鲜样中尼古丁，2 min的提取量最大，此后尼古丁提取量未随均质时间延长而上升，选择食用菌鲜样的高速均质时间为2 min；超声提取，食用菌干样中尼古丁，提取时间达到20 min时提取量最大，此后尼古丁的提取量未随提取时间增加而上升，因此确定食用菌干样的超声提取时间为20 min。

2.2 电泳参数确定

2.2.1 缓冲溶液的选择

毛细管电泳，缓冲液起着保持管壁双电层稳定的重要作用，同时不同的缓冲体系会产生不同的分离效果。因此选择合适的缓冲体系十分必要，缓冲溶液须稳定、不电解且不与目标分析物产生气体或沉淀等化学反应。尼古丁的电泳分析，一般采用磷酸盐缓冲液和酒石酸缓冲液，但是酒石酸缓冲较磷酸盐缓冲液，峰更高，也有效降低了该分析方法对尼古丁的检测限，因此选择酒石酸缓冲溶液为本方法的缓冲体系。

2.2.2 缓冲溶液pH的选择

缓冲溶液的pH直接影响毛细管表面的电荷密度，pH的变换能明显改变分析物的电荷和电渗流的大小，影响分离效率。上机后分析表明，随着pH的上升，样品出峰时间逐渐缩短，峰面积也逐渐变小；随着pH的下降，峰面积逐渐变大，出峰时间逐渐延长，且峰形变宽。综合考虑检测效率及峰形，选取酒石酸缓冲溶液pH为3.2。

2.2.3 缓冲溶液浓度的选择

为了保持缓冲溶液的pH的稳定性，通常缓冲溶液要保持一定的浓度。浓度低则缓冲能力差，电渗流不稳定，分析结果重现性差。浓度增加则缓冲能力增加，毛细管内壁扩散层厚度下降，改善峰形；但是浓度过高则会使电流增大，产生的热效应会引起峰展宽，不利于分析物的分离。在试验中考虑检测效率及峰形，最终选择酒石酸缓冲溶液浓度为350 mmol/L。

2.2.4 电泳电压的选择

毛细管电泳的分离效率和分离度与电泳电压有线性关系。电泳的电压低，样品出峰时间变长，柱效低分离度变低。电压高，样品迁移快，柱效高，但是电压过高会导致电流增加，引起毛细管中产生大量焦耳热，影响溶质迁移速度造成区带展宽，柱效下降，所以选择的分析电压为12 kV。

尼古丁标准溶液毛细管电泳图如图1所示。

图1 0.02 μg/mL尼古丁标准溶液电泳谱图

2.3 方法性能检验

根据毛细管电泳条件检测计算，得出尼古丁的线性方程为Y=16.9832X+0.1703，R2=0.9995。方法准确度试验结果表明，尼古丁在食用菌样品中的加标回收率为76.1%～103.2%，证明该方法的准确度较高。重复性试验中日内变异系数在1.09%～2.83%，鲜样和干样的日间变异系数分别为2.75%和1.62%。且通过计算，方法检出限0.001 μg/mL，定量限为0.003 μg/mL。

应用上述方法，对代表性食用菌品种（牛肝菌、木耳）中的尼古丁进行了测定，测定谱图如图2和图3（木耳干样未检出）。结果表明：本方法原理明确，测定方法科学合理，方法简单快速，兼容性强，整个方法的灵敏度、准确度、精密度均符合食用菌产品测定的要求，满足目前对食用菌产品中尼古丁的测定要求。

图2 牛肝菌鲜样电泳谱图

图3 木耳干样电泳谱图

3小结

试验结果表明，毛细管电泳－紫外检测的准确性、选择性、重现性均良好，是一种有效定性定量分析食用菌中尼古丁含量的新方法。最优化条件：以酒石酸缓冲溶液，pH为3.2，浓度为350 mmol/L，进样时间10 s，分析电压12 kV，紫外检测器波长254 nm，尼古丁与其他杂质在12 min内可基本实现基线分离。该方法高效、简单、稳定，适用于食用菌中尼古丁的检测，能满足对食用菌产品安全监控的要求。