不同肌腱处理方法对同种异体肌腱生物学性能的影响

张增亮 胡先同 牛国珍 张迎龙 李利 赵彦涛

肌腱和韧带损伤或撕裂是临床常见问题，常用自体肌腱移植进行修复，能够取得较好的效果。但自体可用肌腱的数量有限，且供区往往存在较多的并发症[1-2]。同种异体肌腱具有来源充足、免疫原性低、强度与自体肌腱相似等优点。随着供体捐献系统的不断完善，同种异体肌腱移植逐渐成为目前修复肌腱缺损最理想的方法。因此，为了减少移植后的不良反应，同种异体肌腱的处理方法显得尤为重要。在本研究中，为了筛选出最佳的肌腱处理方法，笔者研究了四种同种异体肌腱处理方法对肌腱生物学性能的影响，为同种异体肌腱的研制和应用提供了实验基础。

材料与方法

一、主要试剂、材料

同种异体肌腱 ( 解放军总医院第四医院中心组织库 )、TnBP ( 天津大茂化学试剂厂 )、Triton X-100( 天津大茂化学试剂厂 )、异丙醇 ( 天津大茂化学试剂厂 )、胰蛋白酶 ( 索莱宝 )、中性甲醛溶液 ( 索莱宝 )、CCK8 试剂 ( 大连美仑 )。

二、处理方法

脱细胞肌腱的制备：根据前期工艺研究，选择四种方法制备脱细胞肌腱。A 组，1% TnBP 处理12 h，纯化水洗 3 次，每次 30 min，然后 1% Triton X-100 处理 12 h，纯化水洗 3 次，每次 30 min，冷冻干燥；B 组，0.5% 胰蛋白酶处理 6 h，纯化水洗3 次，每次 30 min，然后 0.5% Triton X-100 处理18 h，纯化水洗 3 次，每次 30 min，冷冻干燥；C 组，1% TnBP 处理 24 h，纯化水洗 3 次，每次30 min，冷冻干燥；D 组，1% Triton X-100 处理18 h，纯化水洗 3 次，每次 30 min，70% 异丙醇处理6 h，纯化水洗 3 次，每次 30 min，冷冻干燥。

大体观察：四种方法处理肌腱后，观察肌腱的大体形态。

去细胞效果观察：取处理后的各组脱细胞肌腱，中性甲醛溶液固定 24 h，梯度脱水、包埋，制作蜡块，并制作 5 μm 石蜡切片，然后进行 HE 染色，镜下观察各组肌腱去细胞效果。

细胞毒性检测：将各组的肌腱剪成 0.2 g 的片段，独立包装，进行辐照灭菌，辐照剂量为 25 kGy。参照 GB / T16886.5 的方法，将辐照灭菌后的各组肌腱按 0.2 g / ml 的比例浸入含 10% 胎牛血清的细胞培养基中，37 ℃ 浸提 24 h 制作浸提液。同时将 L929细胞按 1×105/ ml 的细胞密度接种到 96 孔板中，24 h 后，各组加入对应的细胞浸提液，空白对照组( BC ) 加入新鲜全培，阴性对照组 ( NC ) 加入钛合金浸提液，阳性对照组 ( PC ) 加入含 5% ( v / v ) 二甲基亚砜的全培。继续培养后 24 h，用 CCK8 法检测各组细胞的增殖情况，评价各组肌腱的细胞毒性。

细胞黏附观察：将各组肌腱分别剪成合适的大小，辐照灭菌后置于 24 孔板中，制备 MC3T3-E1 细胞悬液，细胞密度 1×105/ ml，将细胞悬液加入放置各组肌腱的 24 孔板中，继续培养后 72 h，扫描电镜观察细胞在各组肌腱上的黏附情况。

兔皮内刺激实验：各组肌腱分别用生理盐水( SC，极性 ) 和棉籽油 ( SSO，非极性 ) 按 0.2 g / ml的比例进行浸提，37 ℃ 浸提 72 h。然后将浸提液按照图1 所示的点位注射到兔的背部皮内，每个点位注射 0.2 ml。24 h 后观察并记录每个点位是否有红肿和焦痂出现。

结 果

一、大体观察及 HE 染色结果

如图2 所示，四种方法处理后，各组肌腱的颜色、形态均未有显著的变化 ( 图2a )。HE 染色结果显示，B 组去除细胞最彻底，纤维排列整齐，结构完整；其它组均观察到有少部分细胞残留 ( 图2b )。

二、细胞毒性结果

CCK8 实验结果显示，A 组和 C 组处理的肌腱细胞毒性较大，为二级毒性，B 组和 D 组处理的肌腱细胞毒性较小，为 1 级毒性 ( 图3 )。

图1 兔背部注射孔排列示意图Fig.1 Schematic diagram of injection holes on the rabbit back

图2 肌腱大体照片及 HE 染色图 ( 200 × )Fig.2 General photos and HE staining pictures of the allogeneic tendon ( 200 × )

三、各组肌腱细胞黏附情况

扫描电镜观察细胞黏附状态。结果显示，四组材料表面均有细胞黏附，A 组和 C 组处理的肌腱上细胞黏附数量较少，且基本呈现圆形；D 组处理的肌腱上细胞黏附数量较多，细胞状态较好；B 组处理的肌腱上细胞黏附数量最多，细胞成片生长，状态较好 ( 图4 )。

四、皮内刺激结果

兔背部皮内刺激实验结果显示，各组极性和非极性浸提液注射后均未出现红肿和焦痂，平均记分均为 0 ( 图5 )。

图3 四种方法处理肌腱的细胞毒性Fig.3 Cytotoxicity of tendons treated with four methods

图4 MC3T3-E1 细胞在四种方法处理的肌腱上的黏附情况Fig.4 Adhesions of MC3T3-E1 cells on tendon treated by four methods

图5 四种方法处理的肌腱皮内刺激情况Fig.5 Intradermal stimulation of tendons treated by four methods

讨 论

肌腱和韧带损伤或撕裂的病例日渐增多，目前肌腱修复的方法主要有 4 类：自体肌腱移植[3-4]、同种异体肌腱移植[5]、人工肌腱置换[6]、组织工程肌腱置换[7]。在这几种修复方法中，自体肌腱移植修复效果最好，是肌腱移植的金标准。但对于肌腱缺损较多或缺损较大的患者，自体移植往往不能满足临床需求；人工肌腱包括聚酯纤维、尼龙、涤纶、碳纤维等，其主要缺点为长期不能腱化、不能吸收、黏连、异物反应等[8]；组织工程肌腱技术难度较大，成本较高，目前尚处于实验阶段。而同种异体肌腱经过简单处理后，能够达到很低的免疫原性和很好的生物相容性，完全能够满足肌腱修复的需求，并且随着供体捐献制度的不断完善，肌腱来源逐渐增多。因此，同种异体肌腱逐渐成为最理想的肌腱缺损修复材料。

在本研究中，笔者根据前期工艺的探索，选取了四种肌腱处理的方法。四种方法的处理时间均为24 h 左右，加上冻干和辐照，整个制备过程可以控制在 48 h 以内，节约了时间成本。从处理效果看，A 组、C 组和 D 组去除了大部分细胞，但仍有少部分细胞残留，而 B 组完全去除了细胞，可能是由于胰蛋白酶的作用，增强了试剂的去细胞效果。细胞毒性结果显示，A 组和 C 组细胞毒性为二级，可能是由于 TnBP 较难清洗，残留较多导致。而 B 组和 D组细胞毒性较小，为一级。细胞黏附结果更直观的印证了细胞毒性结果，A 组和 C 组处理的肌腱上细胞黏附较少，且细胞呈球形，说明细胞活力较差，而 B 组和 D 组处理的肌腱上细胞黏附较多，且细胞伸展状态较好，说明细胞活力较强。最后，兔背部皮内刺激实验验证了各组材料在动物体内的相容性。结果表明，虽然 A 组和 C 组处理的肌腱具有一定的细胞毒性，但各组在皮内刺激实验中均未表现出刺激反应。这可能是由于动物体内体液的循环，稀释了浸提液中的刺激性物质。综合以上结果，四种方法处理的肌腱中 B 组和 D 组处理的肌腱的生物相容性更好，特别是 B 组处理的肌腱，不但完全去除了细胞，而且具有最小的细胞毒性，最好的细胞黏附。

在四种肌腱处理方法中，0.5% 胰蛋白酶＋0.5%Triton X-100 的处理方法最为理想。