高通量基因测序技术检测早期流产绒毛染色体异常及相关因素分析

许展，程东凯，于洪君，李宝山，刘双

（沈阳东方菁华医院有限公司，辽宁 沈阳）

0 引言

妊娠早期流产是通过辅助生殖治疗(ART)怀孕最常见的并发症，胚胎染色体异常约占这些损失的50%[1]。据报道，与自然受孕相比，ART所用的技术可能会增加怀孕产生染色体异常的风险，并导致早期妊娠损失[2]。G显带核型分析是染色体分析的传统方法，对探讨自然流产的原因具有重要意义。然而，G显带的核型分析受到染色体准备不良、培养失败和母体细胞污染的等因素的限制。分子核型方法，如多重荧光原位杂交(mFISH)，多重连接依赖探针扩增(MLPA)，定量实时聚合酶链反应(qPCR)，克服了传统细胞遗传学技术固有的一些缺点[3,4]。然而，他们因其分辨率有限和/或整个基因组覆盖范围有限而受到质疑。在本研究中，我们应用高通量测序技术来检测早期自发性流产的女性绒毛样本，分析流产可能发生的原因，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 样本收集和DNA提取

本研究经沈阳东方菁华医院机构审查委员会批准。在知情同意的情况下，收集了2015年1月至2018年12月189例自发性流产妇女的绒毛样本（ART共166例，自然妊娠组共23例）。每个样品在生理盐水中漂洗三次。然后用DNA提取试剂盒提取10mg组织以提取基因组DNA（天根生化科技（北京）有限公司）。

1.2 高通量测序技术进行染色体拷贝数分析和验证

使用Ion torrent PGM试剂盒(ThermoFisher，美国)将绒毛样本基因组DNA剪切至250-300 bp片段。使用Ion Plus片段库工具包(ThermoFisher，美国)构建离子种子条形码库。使用IonPGM模板OT2 200试剂盒（美国ThermoFisher）用于模板扩增和靶序列富集。使用Ion OneTouch ES（ThermoFisher，美国）回收离子球颗粒（ISP）并富集模板阳性ISPs。使用Ion PGM Sequencing 200 Kit v2（ThermoFisher，USA）在'318'测序芯片上进行测序，共有500个核苷酸流，平均读取长度为220-230 bp。10个DNA样本汇集在一起，并在“318”芯片上标记不同的条形码。全基因组序列平均深度为～0.02×，平均读数为～500k。主要测序BAM数据提交到Celloud cloud服务器(http://www.celloud.org/)，该服务器由第三方公司(JBRH，中国)提供，用于分析染色体拷贝数变异(CNVs)。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，数据统计采用χ2检验，当1≤理论频数＜5，用校正χ2检验比较P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 异常核型情况

189例绒毛组织中染色体异常124例，正常65例，染色体异常率65.61%（124/189）。流产组织染色体非整倍性发生率为65.61%（124/189），其中三倍体占37.10%（46/124）。三倍体中发生频次以16三体占比最高，可达23.91%（11/46）、其次是22三体占21.74%（10/46）以及Turner综合征占8.70%（4/46）。见表1。

表1 异常核型情况

2.2 孕妇年龄与绒毛染色体异常发生率

孕妇年龄大于35岁组染色体异常发生率明显高于年龄小于35岁组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 孕妇年龄与染色体异常发生率

2.3 初次自然流产和复发性流产绒毛染色体异常发生率比较

既往有2次及2次以上自然流产病史的孕妇染色体异常68%（17/25）虽高于首次发生自然流产患者65.24%（107/164），但差异无统计学意义，P＞0.05。见表3。

表3 自然流产次数与染色体异常发生率

2.4 自然妊娠和ART妊娠绒毛染色体异常发生率比较

ART组与NC（自然妊娠）染色体异常率分别为64.46%（107/166）、73.91%（17/23），差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 自然妊娠与ART妊娠绒毛染色体异常发生率

2.5 孕周与绒毛染色体异常发生率

孕周大于9周的患者染色体异常率73.24%（52/71）也略高于孕周小于9周的患者61.02（72/118），但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 5。

表5 孕周与染色体异常发生率

3 讨论

辅助生殖技术已成为许多不孕不育夫妇的重要治疗手段和基本技术。虽然多个不孕不育治疗中心ART妊娠率稳定在40%左右，但带回家的婴儿率仍为20-30%，其中一个重要原因是早期自然流产率较高的[5]。妊娠早期流产在所有临床诊断的妊娠中占10%-15%，其中胚胎染色体异常是自发性流产最常见的原因，约占60%。然而，ART术后患者的早期自然流产率在22%-63%之间。ART治疗的失败与许多因素有关，遗传缺陷尤其是胚胎染色体异常是导致妊娠早期自发性流产的主要原因之一[6]。

妊娠产物的细胞遗传学分析是探讨自然流产原因的基础。多重细胞遗传学分析表明，在不同的人群中，妊娠早期流产的非整倍率在50%-80%之间[7]。细胞遗传学的异常核型包括常染色体三体、性染色体单体、三倍体、双三体、多倍体以及结构重排。其中常染色体三体是最常见的染色体异常。

常规g显带染色体分型是检测染色体非整倍性和不平衡的金标准方法。但总体检测失败率约为20%，有时由于母体细胞相对于胎儿细胞过度生长而出现假阴性结果。最近，高通量测序技术被证实能够可靠地检测绒毛样本中的CNVs[8]。Array CGH和NGS都是高通量的基因检测平台，对传统的细胞遗传学产生了革命性的影响[4,9]。本研究采用NGS方法检测染色体拷贝数分析异常，对流产胚胎染色体异常检出率65.24%。本研究分析了流产组织染色体非整倍性发生率，其中三倍体占37.10%，三倍体中发生频次以16三体占比最高，可达23.91%。

母体高龄、核型改变、多种辅助生殖技术(ART)失败、多次流产、Mesa-Tese获得精子等不良因素导致胚胎染色体异常风险增加[10]。在ART中，孕妇年龄可能被认为是影响妊娠结局的最重要因素。对于不育夫妇，流产的风险和非整倍体率已知会随着产妇年龄的增长而高度增加[11]。本研究结果指出孕妇年龄大于35岁组染色体异常发生率明显高于年龄小于35岁组，差异有统计学意义。尽管尚未完全理解年龄效应的发病机理，但认为它是由卵母细胞中第一减数分裂产生的错误引起的[12]。随着年龄的增长，女性的卵母细胞减数分裂错误的发生率增加，这是由于卵子在排卵前被阻滞在第一减数分裂中的时间延长。而减数分裂纺锤体形态也被发现随着母体年龄的增加而发生有害地改变。

此外，本研究还发现流产次数对胚胎染色体异常无显著影响，ART也并没有增加胚胎染色体异常率。

综上，染色体异常是胚胎早期停止发育流产的重要原因，其中孕妇高龄可能使胚胎染色体异常发生的几率增高，高龄人群应更注重孕早期胎儿染色体检查；与NC相比ART不会增加胚胎染色体异常的发生率。