核酸适配体在消化系统疾病中的应用

蔡凌宇，王孝通，孔桂美★

（1.扬州大学医学院（转化医学研究院），江苏 扬州；2.江苏省老年病防治重点实验室，江苏 扬州）

0 引言

二十世纪九十年代初，核酸适配体(aptamer)和基于指数富集的配体系统进化（SELEX）技术这两个影响深远的概念被提出。简而言之，即通过体外PCR扩增技术与大容积的核苷酸文库，筛选出与噬菌体T4DNA聚合酶特异性结合的一段寡核苷酸序列（RNA或DNA）。自此，由于核酸适配体的筛选效率大大提高，与靶标的亲和力、特异性、分子稳定性、生产工艺可比肩抗体，核酸适配体在生物医学领域的应用空间就愈发广泛了。

1 核酸适配体用于在临床实验诊断

1.1 应用于胃癌诊断

目前，胃癌仍是全球癌症主要相关死因之一，占癌症死亡总数的8.2%[1]。有研究分析表明CT、MRI及PET-CT等检测技术在诊断胃癌有无淋巴结转移存在一定不足；而病理学检测则存在操作繁琐、假阳性高等问题[2]。因此，更可靠、准确、操作简单的预测生物标志物对于胃癌的诊断、分期、靶向治疗及提高生存率是极有价值的。而核酸适配体能够作为示踪剂应用到疾病的诊断与成像上，并最终将结合的各类药物或毒素递送到靶组织中且其自身也可以直接抑制靶蛋白，从而在体内显像[3]。目前，学者们通常使用细胞SELEX技术，即以整个胃癌细胞为筛选靶标，利用细胞表面的不同结构组成或蛋白质的多样性，筛选出能够特异性结合靶细胞的核酸适配体。而为了使筛选的核酸适配体获得更强的结合特异性，通常会在筛选过程中引入消减的策略，并在每轮正向筛选后加入一个反向筛选[4]。通过细胞SELEX技术成功筛选到了多条胃癌核酸适配体，如表1。

表1 通过细胞SELEX技术筛选出的胃癌核酸适配体

除了以胃癌细胞为筛选靶标进行细胞SELEX筛选也有其他相关报道，如以正常血清和牛血清白蛋白（BSA）的等体积混合物作为反筛物质，以用适配体Bio-Ap7 (生物素标记) 及所建立生物素-链霉亲和素磁珠方法提取到过氧化物酶4（PRDX4）蛋白作为正筛目的蛋白质，利用消减SELEX技术筛选核酸适配体Ap-EGACS-11、Ap-EGACS-5。经过进一步特异性和亲和力分析后，PRDX4是具有特异性早期胃癌血清标志物的潜能，且Ap-EGACS-11可直接作为早期胃癌的检测试剂[9]。另有学者[10]以胃癌及非癌性血清互为正筛与消减的靶标，利用双向热循环消减SELEX技术，实现特异性筛选。并通过最终鉴定，显示其亲和力均在纳摩尔水平。除此之外，也有学者利用[11]毛细管电泳法成功筛选出针对Mucin16胞外域的核酸适配体，不仅为胃癌腹腔转移的诊疗中提供了新的靶向分子，也为筛选提供了新的思路。

1.2 应用于幽门螺杆菌诊断

幽门螺杆菌是胃癌的主要致病菌[12-13]，目前，快速尿素酶试验和尿素呼气试验是临床和组织学中常用的检测幽门螺杆菌的方法，需要大量的时间和严格的操作环境，并且需要从病人身上实际采集样本。固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术可以检测幽门螺杆菌释放的挥发性有机化合物[14]，但是过程复杂，并且需要昂贵的设备与高技能人员的支持。高亲和力的核酸适配体可以实现对幽门螺杆菌感染的有效、迅速、简单的识别，如核酸适配体hp4[15]，可对幽门螺杆菌表面重组抗原（HP-Ag）具有较高的亲和力与选择性，能够特异性检测幽门螺杆菌。

1.3 应用于肠癌诊断

尽管继肺癌之后，结直肠癌为男性癌症死亡的主要原因[1]，但是核酸适配体诊断结直肠癌的系统尚处于萌芽时期，需要更多低廉简易的纳米材料来促进其发展[16]。Tertis M 等[17]在修饰的电极表面固定针对白细胞介素-6的核酸适配体，通过电化学阻抗光谱法进行检测，用于血液检测结直肠癌，效果良好。

1.4 应用于肝癌诊断

临床工作中，肝癌是发病率和病死率均较高的恶性肿瘤之一，其发展趋势依旧十分严峻[1,18]。早发现、早治疗逐渐成为改善肝癌患者预后和降低病死率的关键因素。以肝癌细胞系为筛选靶标进行细胞SELEX所占比例较大并且具有针对性，以肝癌血清、临床肝癌组织为靶标的核酸适配体筛选则可能为以后适配体发展提供新的思路[19]。

1.5 应用于胰腺癌诊断

胰腺癌作为目前死亡率最高的癌症之一，其诊断也已经成为热门研究方向[20-21]，目前已有学者通过小鼠模型研究核酸适配体改善临床用药[22]。

1.6 应用于胆管癌诊断

目前，学者们对胆管癌细胞研究较少，多以人肝癌细胞株SMMC-7721为对照细胞进行多轮筛选，如叶玲[23]筛选出两条对胆管癌细胞有高度特异性的核酸适配体y119和y123，并通过流式细胞术证实其可对非胆管癌细胞有良好的区分度。

1.7 应用于肝炎诊断

核酸适配体对于肝炎的研究从上个世纪起就已经开始，通常将适配体或肝炎病毒固定于某一载体上进行检测。Xi Z 等[24]采用磁性纳米颗粒作为载体，将乙肝表面抗原HBsAg进行固定化，筛选DNA适配体，并基于磁分离和免疫分析，对临床血液标本进行检测，即使在有干扰物质存在的情况下，核酸适配体也能很好的工作，并且具有良好的特异性；将适配体将固定于原子力显微镜芯片表面，作为分子探针进行检测[25]，发现A14序列的适配体即可用于整个丙型肝炎病核心抗原浓度的分析；Lee S等[26]利用溶胶-凝胶固定方法固定高特异性的核酸适配体研制HCV生物传感器。

1.8 应用于胃肠道病原微生物诊断

核酸适配体在检测胃肠道病原微生物上也获得较好的发展，除了传统的培养方法外，已报道的对病原体检测的方法还有聚合酶链反应、免疫学检测、基因芯片和其他生物传感方法[27-30]。

近些年，利用表面增强拉曼光谱技术（SERS）进行细菌的快速检测成为研究热点。Ma X等[31]提出了SGNP-SERS生物传感器，将拉曼信号分子p-MBA和硫酸化的斑疹伤寒核酸适配体附着于棘状金纳米粒子（SGNPs）表面，作为SERS纳米探针。另一方面，将生物素化适配体固定在微效价板上，用SERS信号定量检测，最终实现对斑疹伤寒杆菌快速的特异性识别与检测。同样基于核酸适配体SERS技术，有学者成功建立快速检测大肠埃希菌O157：H7的方法[32]，但是其方法对于特异性检测肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)等血清型仍需要更多的学者进一步研究。

另外，随着微芯片技术的发展，微芯片毛细管电泳（MCE）也由于其反应速度快、信息量大、允许使用微量样品和试剂等优点，引起学者们极大的兴趣。如：Law W S等[33]描述了MCE测定肠道致病菌大肠杆菌的方法。而Zhang Y等[34]根据细菌适配体(ST1)复合物与游离适配体电荷质量比的差异，利用MCE方法分离细菌适配体复合物与游离适配体。Bayraç C等[35]则首次展示应用肠沙门氏菌适配体crn-1、crn-2构建基于毛细管的三明治式检测平台。

除此之外，还有研究[36]首创荧光生物传感策略，即利用目标分子-核酸适配体之间的特异性结合诱导酶修复放大反应，实现循环酶切放大反应，从而实现了超灵敏和高特异的沙门氏菌检测。较传统检测方法而言，操作更简单、快速且具有更高的灵敏度和更好的重现性。Duan N等[37]首次报道了细胞SELEX技术筛选痢疾杆菌适配体S1，并将适配体固定在微板上，形成三明治式荧光检测方法。基此，有研究[38]利用金属有机骨架材料(Uio-66-NH2)对核酸适配体的吸附特性及荧光猝灭特性，成功构建了针对沙门氏菌检测的荧光生物传感器。更值得一提的是，有利用表面等离子体共振（SPR）技术，以核酸适配体作为免疫识别元件，通过芯片表面光线发生的折射变化对食品中肠炎沙门氏菌进行快速、准确、特异地识别检测[39]。

2 核酸适配体在消化道疾病治疗中的应用

2.1 作为载体进行药物运输

核酸适配体与药物的结合形成一种运输工具，核酸适配体耦连药物的模型正在进行广泛的临床前评价。Zhu G等[40]提出的“纳米火车”的核酸适配体耦连药物模型可以让阿霉素（DOX）有效的杀伤肿瘤细胞；Li W等[41]通过核酸适配体L33，构建了抗肿瘤药物阿霉素的靶向运输系统(L33-DOX)，该运输系统不仅选择性地杀伤肿瘤细胞，还可以降低对非靶细胞的毒副作用。

基于各种纳米材料如脂质体、聚合物胶束、聚合型纳米载体、仿生型纳米载体、其它纳米载体等[42]，核酸适配体靶向的纳米药物结构可以被成功建立。核酸适配体靶向的纳米药物或成为各种大分子向肿瘤细胞传递的先导分子，可被用于治疗特定的疾病。Li Y等[43]使用核酸适配体与纳米材料形成的复合产物作为结直肠癌的靶向治疗药物，促使DM1（美登素衍生物，一种细胞毒性强烈的抗癌药物）诱导直肠癌细胞的凋亡，并降低抗癌药物对非癌性细胞的细胞毒副作用。Zheng H等[44]已经将乙肝病毒表面抗原核酸适配体附着在琼脂糖微球表面，连接链霉素，制备新型血液吸附剂，可以对HBV感染患者血清中HBsAg进行吸附去除，且没有细胞毒性。

核酸适配体可结合细胞表面受体的特性实现了将物质靶向运输至特定的细胞或组织中的愿景[45]。Liu Z等[46]基于临床病例标本，通过免疫荧光成像分析技术，评估了核酸适配体SYL3C在上皮细胞粘附分子（EpCAM）的表达能力，从而说明适配体SYL3C可以代表一类能针对食管癌（EC）的运载工具，间接表明了EpCAM可以作为食管癌的治疗靶点；另外，其研究团队还利用相同的EC组织切片进行竞争性结合试验，为适配体和抗体联合双相加载靶向治疗提供理论依据。Yoon S等[22]在胰腺导管腺癌（PDAC）小鼠模型基础上通过C/EBPα小激活RNA（C/EBPαsaRNA）与核酸适配体TR14结合，发现其结合物可联合吉西他滨治疗有明显的抗肿瘤作用，推论核酸适配体-C/EBPα-saRNA可作为潜在佐剂，并可能辐射到其他类型的肿瘤应用。

2.2 作为药物进行消化道疾病治疗

自美国FDA在2004年批准第一个核酸适配体药物哌加他尼钠[47]治疗年龄相关性黄斑变性以来，越来越多的学者们关注核酸适配体结合信号转导分子的特性，以期待将其研制成可阻断信号传导的抑制剂[48]。Z Li 等[49]利用实验性结肠炎小鼠模型，通过2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导小鼠结肠炎，腹腔注射补体成分5a（C5a）。其结果表明，C5a寡核苷酸适配体可以降低由TNBS诱导的小鼠血清中特定细胞因子（如IL-6INFγ等）水平，推测C5a适配体可能是治疗炎性肠病的潜在治疗方案。尽管由于SELEX技术的专利限制一定程度上影响了核酸适配体产品商业化进程，加之临床实验研究阶段周期长，导致目前能应用于消化系统疾病的核酸适配体药物少之又少。但是，核酸适配体药物的开发终将会在消化道疾病治疗方面，尤其是癌症治疗方面提供一个新的平台，从而显著改善人类健康。

3 讨论

目前单克隆抗体仍然占据靶向诊断与治疗的大部分市场，但其高昂的生产成本仍然给临床带来极大的困扰。人们需要更多的易于合成，亲和力更高的生物标志物。而随着核酸适配体技术提出及深入发展，核酸适配体技术的基础研究和商业化开发呈爆发式增长。尽管核酸适配体在临床应用有极大的潜力和优势，但其筛选技术还需要进一步提升。

在基础研究方面，由于细胞表面分子的复杂与筛选过程复杂，难度大等问题，每次筛选并不都能保证得到理想的核酸适配体。高效的标准化SELEX筛选技术成为其应用的关键。除此之外，有学者认为[15]，未来的核酸适配体的研究需要考虑核酸适配体的潜在核降解。尽管学者们也一直在不断改进化学修饰和选择方法，然而目前没有统一的标准确定修饰出的核酸适配体是最能满足需求的。另外，还需要针对不同的核酸适配体及不同的应用条件，对修饰方法进行个体化考量。

在临床试验方面，人们获得的有效数据还不够（如哌加他尼钠现已暂时退出市场）而且大多数基于核酸适配体的产品仍处于临床前的研发阶段。并且临床用药安全性评价体系、临床试验方案及上市后临床监测等还需要不断考量。

但是，无论如何，核酸适配体在疾病诊断与治疗上的潜力都是可见的。可以预测，在不久的将来，基于核酸适配体的诊断、治疗技术很可能会与现有的抗体技术一样成为主流方法甚至将其取代。