植物乳杆菌培养基的优化

高玉荣 李大鹏 张凤琴

摘要：为了提高植物乳杆菌的活细胞数，以普通营养肉汤培养基为基础培养基，通过单因素试验和正交试验对植物乳杆菌的培养基进行优化。结果表明，葡萄糖、酵母浸粉、硫酸镁和番茄汁对植物乳杆菌G1-28的生长有显著性的影响。通过正交试验确定植物乳杆菌G1-28最佳的培养基为葡萄糖添加量1.5%，酵母浸粉添加量2.5%，硫酸镁添加量0.3‰，番茄汁添加量5%，在此条件下活细胞数达19.8×109 CFU/mL。

关键词：植物乳杆菌;培养基;活细胞数;正交试验

中图分类号：Q93     文献标志码：A    doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.01.005

Abstract：In order to increase the viable number of Lactobacillus plantarum，the nutrients required for the growth of Lactobacillus plantarum were optimized by single factor experiment and orthogonal experiment based on the medium of common nutritional broth. The results showed that the concentrations of glucose，yeast extract，magnesium sulfate and  tomato juice as growth factor had significant effects on the growth of Lactobacillus plantarum G1-28.  The optimal medium of was glucose 1.5%，yeast extract 2.5%，magnesium sulfate 0.3‰ and tomato juice 5%. At these conditions，the viable number of Lactobacillus plantarum G1-28 was 19.8×109 CFU/mL.

Key words：Lactobacillus plantarum;culture medium;viable cell number;orthogonal experiment

0   引言

随着人们生活水平的提高，开发富含益生菌等具有改善人体健康功能的食品已经成为食品行业的重要发展方向之一[1]。研究表明，植物乳杆菌是一种重要的益生菌，能分泌抗生物素类物质，对肠道致病菌产生的拮抗作用，从而对人体产生益生作用[2]。除此之外，某些益生菌还具有同化胆固醇、提高免疫力、抗氧化等特殊保健功能[3]。

为了更好地发挥益生菌的保健功能，必须获得大量的益生菌活细胞。高密度培养技术是目前获得高活菌数的有效方法。高密度培养技术是指微生物菌体在液体培养基中培养后其细胞密度达到常规培养的10倍以上的生长状态[4]。一些学者对提高益生菌活细胞数的培养基及培养条件进行了研究，取得了一定的研究进展[5-6]。

前期试验從发酵食品中分离筛选到一株具有体外降胆固醇、降甘油三酯功能的益生菌植物乳杆菌G1-28。为了更好地发挥植物乳杆菌G1-28的益生作用、获得大量的活细胞，试验以营养肉汤为基础培养基，对植物乳杆菌G1-28的培养基进行了研究和优化。

1   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   菌种

植物乳杆菌G1-28，从发酵食品中分离的具有体外降胆固醇和甘油三酯功能的益生菌，于巢湖学院食品工程实验室保藏。

1.1.2   试剂

MRS培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司提供;氢氧化钠、葡萄糖、果糖、乳糖、淀粉、蛋白胨、酵母浸粉、硫酸铵、硝酸钠、牛肉膏、硫酸镁、氯化钠、盐酸，均为分析纯。

1.1.3 仪器设备

TU-1810型紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限公司产品;LDZM-80KCs-III型立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂产品;PHB-401型PH计，上海天达仪器有限公司产品;SHP-160型智能生化培养箱，上海三发科学仪器有限公司;TG16Ws型台式高速离心机，湘仪离心机仪器有限公司产品;SW- CJ-2F型洁净工作台，苏州市智拓净化设备科技有限公司产品。

1.2   试验方法

1.2.1   菌种活化及培养

将-20 ℃甘油管保藏的菌种，按照1%的接种量接入10 mL已灭菌的MRS液体培养基中，于37 ℃下静置培养12～14 h进行活化。然后，按照1%的接种量接入装有50 mL 已灭菌的MRS液体培养基中，于37 ℃下静置培养12～14 h备用。

1.2.2   植物乳杆菌培养基的单因素试验

（1）碳源的选择及其质量分数的确定。以营养肉汤培养基为基础培养基，分别以1%的葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、淀粉代替其中的碳源，培养后测定其对植物乳杆菌G1-28生长的影响。培养条件为初始pH值6.0，接种量2%，于30 ℃下静置培养16 h（下同）。以氮源1%，NaCl 0.5%为基础，研究0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%碳源对植物乳杆菌G1-28生长的影响。

（2）氮源的选择及其质量分数的确定。以营养肉汤培养基为基础培养基，分别以1%的蛋白胨、酵母浸粉、硫酸铵、硝酸铵、牛肉膏替代其中的氮源，培养后测定其对植物乳杆菌G1-28生长的影响。在确定的最佳氮源的基础上，研究0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%的氮源对植物乳杆菌G1-28生长的影响。

（3）硫酸镁对植物乳杆菌生长的影响。在营养肉汤培养基中分别添加0，0.2‰，0.4‰，0.6‰，0.8‰，1.0‰硫酸镁，培养后测定其对植物乳杆菌G1-28生长的影响。

（4）番茄汁对植物乳杆菌生长的影响。将新鲜成熟番茄清洗干净后去蒂去皮，切块放入榨汁机中压榨，得到新鲜的番茄汁。添加0，5%，10%，15%， 20%新鲜番茄汁，培养后测定其对植物乳杆菌G1-28生长的影响。

1.2.3   植物乳杆菌培养基研究的正交试验

在单因素试验的基础上，进行四因素三水平的正交试验。

1.2.4   植物乳杆菌生长量的测定

采用平板计数法测定植物乳杆菌活菌数[7]。将菌悬液进行10倍梯度稀释，从中选择3个合适的菌悬液各0.1 mL，涂布在制备好的MRS固态培养基平板表面，于37 ℃下倒置培养24 h，计数平板表面生长的菌落数，乘以稀释倍数，即为植物乳杆菌G1-28活细胞数。

2   结果与分析

2.1   植物乳杆菌培养基的单因素试验

2.1.1   碳源对植物乳杆菌生长的影响

（1）碳源种类对植物乳杆菌生长的影响。

碳源种类对植物乳杆菌生长的影响见图1。

由图1可知，植物乳杆菌G1-28在以葡萄糖为碳源的培养基中最高，乳糖和果糖相对较低，蔗糖和淀粉最低，表明葡萄糖作为植物乳杆菌G1-28的碳源，能更好地被利用并促进其生长繁殖。

（2）葡萄糖添加量对植物乳杆菌生长的影响。

葡萄糖添加量对植物乳杆菌生长的影响见图2。

由图2可知，植物乳杆菌G1-28在葡萄糖添加量为1.5%的培养基中活菌数最高，随着葡萄糖添加量的增加，活菌数呈现下降趋势，可能是由于葡萄糖添加量过高会导致菌体呼吸加快，使一些代谢产物不能完全氧化而积累在培养基中，导致培养基中的pH值过低，影响某些酶的活性，不利于植物乳杆菌G1-28的生长。因此，选择1.5%的葡萄糖作为植物乳杆菌G1-28生长的适宜添加量。

2.1.2   氮源对植物乳杆菌生长的影响

（1）氮源种类对植物乳杆菌生长的影响。

氮源种类对植物乳杆菌生长的影响见图3。

氮源是用于构成菌体细胞物质和代谢产物的氮素来源，通常可以分为有机氮源和无机氮源。由图3可知，植物乳杆菌在添加酵母浸粉、蛋白胨和牛肉膏等有机氮源的培养基中的活菌数显著高于添加硫酸铵和硝酸铵等无机氮源的培养基。在有机氮源中酵母浸粉最利于植物乳杆菌G1-28的生长。因此，确定酵母浸粉为植物乳杆菌G1-28生长所需的最佳氮源。

（2）酵母浸粉添加量对植物乳杆菌生长的影响。

酵母浸粉添加量对植物乳杆菌生长的影响见图4。

由图4可知，酵母浸粉添加量在0.5%～2.0%时，植物乳杆菌活菌数呈上升趋势，但当酵母浸粉添加量大于2.0%时则呈下降的趋势，因此选择酵母浸粉添加量为2.0%。

2.1.3   硫酸镁对植物乳杆菌生长的影响

硫酸镁添加量对植物乳杆菌生长的影响见图5。

由图5可知，硫酸镁对植物乳杆菌G1-28生长的影响显著，在硫酸镁添加量为0.3‰的培养基中，活细胞数最大，但当硫酸镁添加量过大（大于0.3‰）时，不利于植物乳杆菌G1-28的生长。因此选择硫酸镁添加量为0.3‰。

2.1.4   番茄汁添加量对植物乳杆菌生长的影响

番茄汁添加量对植物乳杆菌生长的影响见图6。

番茄汁含有丰富的维生素、微量元素等营养成分可以为乳酸菌提供糖类、矿物质和B族维生素等多种营养成分。由图6可知，番茄汁添加量对植物乳杆菌G1-28的生长有促进作用。在番茄汁添加量为0～10%的培养基中，植物乳杆菌G1-28活菌数呈增加的趋势;当番茄汁添加量大于10%时，呈现明显的下降趋势，可能是由于番茄汁添加量过高，导致培养基的pH值过低，不利于植物乳杆菌G1-28的生長，因此选择番茄汁的适宜添加量为10%。

2.2   植物乳杆菌培养基的正交试验

根据单因素试验的结果，采用了L9（34）正交试验。

正交试验设计见表1，正交验结果见表2。

由表4可以看出，各因素对植物乳杆菌G1-28生长的影响次序依次是酵母浸粉添加量>葡萄糖添加量>番茄汁添加量>硫酸镁添加量。最佳培养基配方为A2B3C2D1，此配方不在正交试验的9组配方中，因此需要进行验证试验。

根据正交试验所获得的最优组合培养基成分，即葡萄糖添加量1.5%，酵母浸粉添加量2.5%，硫酸镁添加量0.3‰，番茄汁添加量5%;在初始pH值6.0，接种量2%，于30 ℃下静置培养16 h，进行3次平行试验，测得植物乳杆菌G1-28活细胞数19.8×109 CFU/mL，验证试验的活细胞数大于正交试验中的任一组合的结果，因此确定A2B3C2D1是最优组合。

3   结论

以营养肉汤为基础培养基，通过单因素试验研究表明，葡萄糖添加量、酵母浸粉添加量、硫酸镁添加量、番茄汁添加量对植物乳杆菌G1-28生长影响显著。

通过正交试验确定植物乳杆菌G1-28最佳培养基配方为葡萄糖添加量1.5%，酵母浸粉添加量2.5%，硫酸镁添加量0.3‰，番茄汁添加量5%，在此条件植物乳杆菌G1-28下活细胞数达19.8×109 CFU/mL。

参考文献：

Rathore S，Salmer N I. Production of potentially probiotic beverages using single and mixed cereal substrates fermented with lactic acid bacteria cultures[J]. Food Microbiology，2012（30）：239-244.

洪青，刘振民，吴正钧，等. 植物乳杆菌的研究进展[J]. 乳业科学与技术，2017，40（6）：33-37.

Lee D K，Jang S，Baek E H，et al. Lactic acid bacteria affect serum cholesterol levels，harmful fecal enzyme activity，and fecal water content[J]. Lipids in Health and Disease，2009，21（8）：1-8.

施大林，孙梅，陈秋红，等. 嗜酸乳杆菌培养基的优化及高密度培养[J]. 食品与发酵科技，2011，47（2）：60-63.

梁璋成，何志刚，任香芸，等. MLF 植物乳杆菌R23 培养基优化[J]. 福建农业学报，2009，24（6）：570 -574.

白永强，于立娟，周慧敏，等. 植物乳杆菌Zhang-LL 高密度发酵的研究[J]. 中国农学通报，2015（31）：285-290.

国家食品药品监督管理总局. GB 4789.35—2016食品微生物学检验 乳酸菌检验[S]. 北京：中国标准出版社，2016. ◇