电针对血管性痴呆大鼠脑白质纤维和学习记忆功能的效果

张冰雪，杨敏光，李建鸿，陶静,,3，梁胜祥，柳维林，陈立典,,3

1.福建中医药大学康复医学院，福建福州市 350122；2.福建中医药大学康复医疗技术国家地方联合工程研究中心，福建福州市 350122；3.福建省康复技术协同中心，福建福州市 350122

血管性痴呆(vascular dementia,VD)又称血管性认知功能障碍，是指由脑血管病变引起的中枢神经系统功能障碍等一系列症状。我国65 岁以上人群中，1.1%～3.0%被诊断为痴呆，其中VD 占0.9%[1-2]。VD已成为仅次于阿尔茨海默病的第二大老年性痴呆疾病[3]，给家庭和社会带来巨大的影响和负担。

脑血管病变包括脑白质损伤、腔隙性梗死和微出血，其中脑白质损伤是造成VD 的重要原因[4]。磁共振弥散张量成像(diffusion tensor imaging,DTI)是在体研究白质的有效工具，主要通过弥散各向异性分数(fractional anisotrophy,FA)等指标，量化观察白质纤维束的完整性[5]，实现可视化研究VD 脑白质损伤[6]。VD患者认知功能障碍与脑白质改变相关[7]，脑白质弥漫性病变甚至早于临床症状出现[8-9]。

针刺在VD治疗中应用广泛。电针可有效增强VD患者的学习和记忆能力[10-11]；针刺可明显改善VD模型大鼠总体认知功能[12-13]。皮质下VD患者脑缺血侧白质纤维FA 降低[14]；VD 患者全脑平均FA 较正常人低[15]。电针干预后，模型大鼠脑缺血灶中心和边缘FA 增加[16]。本课题组前期研究证实，电针百会、神庭能影响痴呆大鼠脑结构，治疗认知功能障碍[17-19]。本研究利用DTI 观察电针百会、神庭前后白质纤维情况，以探讨电针治疗VD可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性Sprague-Dawley 大鼠，购于上海斯莱克实验动物公司，生产许可证号SCXK(沪)2014-0002，体质量(280±30) g。于福建中医药大学SPF 级实验动物中心分笼喂养，许可证号SYXK(闽)2014-001。全部动物实验伦理均通过动物管理委员会审批，并严格遵从国际动物保护法规施行。

1.2 仪器和试剂

戊巴比妥钠(CQ6125000)：SIGMA 公司。动物用青霉素钠：山东鲁抗。异氟烷(R510-22)：RWD 公司。小动物磁共振成像仪(MiniMR-60 MRI system 7.0 T)：德国BRUKER 公司。SDZ-V 型电针仪、华佗牌毫针(直径0.25 mm、长13 mm)：苏州医疗用品厂有限公司。

1.3 模型与分组

将大鼠分为造模组和假手术组(n=8)。造模组参照Huang 等[20]的方法造模。大鼠术前禁食24 h，随后称重。大鼠用2%戊巴比妥钠2 ml/kg 腹腔注射麻醉，仰卧置于专用手术保温垫上，四肢用医用胶带粘附固定，不可粘贴过紧，以免出现四肢末端缺血损伤。75%酒精于锁骨上缘至颌下约5×3.5 cm 区域消毒，剔毛备皮。镊子夹起颈部皮肤，沿正中线切开，从左侧胸骨舌骨肌、胸锁乳突肌和肩胛舌骨肌交叉点向下分离，找到左颈总动脉，显微镊小心分离颈总动脉与迷走神经，在颈总动脉与迷走神经间穿一条不可吸收的外科缝合线，结扎左颈动脉。5 min 后同法分离并结扎右颈总动脉。假手术组仅分离双侧颈总动脉，不进行结扎。清洁创口，缝合皮肤。腹腔注射动物用青霉素钠溶液0.5 ml/kg。大鼠置于盛有木屑的托盘内，26 ℃左右室温，自然苏醒，回笼饲养。

术后12 d 对大鼠行新物体识别试验[23]。与假手术组相比，造模组中新物体偏爱系数降低的大鼠视为造模成功。纳入模型大鼠24只，随机数字表法分为模型组(n=8)、非穴组(n=8)和电针组(n=8)。

1.4 干预方法

术后14 d，电针组参照方剑乔等[21]的定位方法取百会、神庭行电针干预，疏密波，频率1/20 Hz，刺激强度1 mA。每天固定时间干预1次，持续30 min。

非穴组取双侧腋下非经非穴点[22]，同法电针干预。

模型组和假手术组同等条件抓取。

1.5 新物体识别试验

造模后12 d (干预前)和40 d (干预前)，于上午9:00～12:00 对大鼠进行测试。在特殊材料制成的80×80×60 cm 无顶敞箱内，放置不易被大鼠推倒的罐子作为识别物体，分为A、B 两组。A 组为两个完全相同物体(A、a)，B 组是一个与A 物体大小相似的物体(B)，且大鼠在生活环境中从未见过。敞箱上方固定光源和摄像机，使用Super Maze动物行为学视频分析系统追踪大鼠的活动轨迹，记录其在敞箱内活动和与物体接触的情况。实验过程中保持敞箱和光源的位置不变，实验过程中保持安静。实验为适应、学习、测试3个阶段，持续3 d。

适应阶段：将实验大鼠放于没有任何物体的敞箱中自由探索10 min。学习阶段：适应24 h 后，在箱内同侧两个角落分别放置物体A 和a，将大鼠背朝物体放入敞箱，自由探索10 min。测试阶段：学习后1 h和24 h，将大鼠熟悉的物体a 换成新物体B，大鼠背对物体放入敞箱，自由探索5 min。

每只大鼠测试前，将敞箱和物体用75%酒精擦拭，以祛除上一只大鼠的气味残留。

判别标准：大鼠用鼻子、胡须、前肢触碰探索物体，或鼻子、胡须与识别物体间的间隔≤2 cm 记为识别行为；趴在物体上向四周探索或在物体旁转身、下蹲均记为识别行为。大鼠在测试阶段探索物体A、B的时间记为T1、T2，偏爱系数β=T2/(T1+T2)×100%。学习后1 h和24 h的偏爱系数记为β1和β2。

1.6 DTI

干预前后，大鼠行DTI 扫描。大鼠3%异氟烷诱导麻醉5 min，100 μg/ml 盐酸美托嘧啶0.5 ml/kg 下肢肌肉注射深度麻醉，俯卧位置于磁共振扫描床上，头部戴专用表面线圈，牙杆和双侧耳杆固定。水循环加热系统维持大鼠体温相对恒定，SurgiVet V3395TPR生理检测仪(美国SMITHS MEDICAL 公司)实时监测大鼠体温、呼吸和心率。扫描参数：TE 32.25 ms，TR 12000 ms，FOV 32×32 mm，Segment 4，Averages 1，Image Size 128×128，Slices 48，b01000 s/mm2，Slice Thickness 0.56 mm，no slice gap。

1.7 统计学分析

采用SPSS 23.0 统计软件进行统计分析。所有数据用()表示，经检验符合正态分布且方差齐，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 法。显著性水平α=0.05。

采用FSL(http://fmrib.ox.ac.uk/fsl)和spmratIHEP[24]软件分析DTI 数据。数据行涡流矫正；手动颅骨剥离得到全脑掩膜图像，计算各动物b0像和全脑FA 像；将b0像配准到大鼠标准脑模板，保留变换函数，实现FA 像向大鼠标准脑膜版的空间标准化[25]；采用3 倍体素平滑核平滑；基于一般线性模型，采用方差分析，对平滑后数据进行统计分析，P＜0.005、团簇＞10为有显著性差异。

2 结果

2.1 新物体识别试验

干预前，与假手术组相比，模型组、电针组和非穴组β1和β2均下降(P＜0.05)，后三组间无显著性差异(P＞0.05)。见表1。

干预后，与模型组相比，电针组β1和β2均升高(P＜0.05)。见表2。

表1 干预前各组新物体偏爱系数的比较(%)

表2 干预后各组新物体偏爱系数比较(%)

2.2 DTI

干预前，与假手术组相比，模型组胼胝体、扣带回、海马、外囊白质纤维FA 降低(图1)。干预后，与模型组相比，非穴组海马白质纤维FA增加(图2)，电针组海马、扣带回、胼胝体、外囊白质纤维FA增加(图3)；与非穴组相比，电针组海马、胼胝体、外囊白质纤维FA 增加(图4)。

3 讨论

VD 属中医“呆病”，基本病机为本虚标实，病位在脑但涉及脏腑。多因气血亏虚，加之内伤劳倦，引起阴阳失调；髓海不足，阳气衰虚；痰浊瘀阻，神机失用，遂为痴呆[26-27]。督脉阳气虚衰所致脏腑功能低下是痴呆病主要原因之一[28]。百会、神庭为督脉要穴，百脉之会，神志所在，是上行之气聚集处。针刺百会、神庭可通行气血、升阳举陷、开窍醒脑，治疗痴呆等神志病变。

针刺疗法能有效治疗VD 所致的认知功能障碍[29-30]。马莉等[31]综述近10 年针刺治疗VD 的相关报道，显示针刺法疗效优于一般药物组或常规治疗组。邵瑛等[32]电针百会等穴，明显改善VD 模型大鼠学习记忆能力。江一静等[33]针刺百会、神庭，提高非痴呆型血管性认知障碍患者的认知能力。本研究显示，电针百会、神庭能增加认知相关脑区白质纤维FA，有效改善VD大鼠学习记忆能力。

图1 模型组与假手术组FA差异图

图2 非穴组与模型组FA差异图

图3 电针组与模型组FA差异图

图4 电针组与非穴组FA差异图

新物体识别试验可检测大鼠的总体认知功能。先让动物熟知两个物体，随后将其中一个换成新物体，动物本能将探寻新物体，较少探寻熟知物体。通过比较对新物体的探寻时间占整个探寻时间的比例判断大鼠的记忆能力。若大鼠对新旧物体的探寻指数无差异，表明大鼠存在记忆障碍。VD 模型小鼠新物体识别试验显示显著的学习和记忆障碍，治疗后新物体辨别指数和辨别系数提高[34]。本研究显示，电针百会、神庭能提高VD大鼠的记忆能力。

白质主要由有髓纤维和胶质细胞组成，连接各皮质，负责神经元间信号传递，对学习、记忆有重要影响[35]，脑白质损伤可引起不同程度认知功能下降[35]。VD 患者的认知功能障碍与脑白质损伤相关[36]。特定位置白质结构完整性与特定认知障碍有关，痴呆患者前额叶、海马等脑区白质纤维受损，导致认知功能障碍[37]。

FA 能量化评价脑白质纤维损伤。VD 患者脑缺血侧白质纤维FA 降低，主要集中于双侧前额叶、扣带回、海马和下额枕束区[8,14]。电针后白质纤维见不同程度重构[38]。本研究显示，VD 模型大鼠电针干预后，白质纤维改变主要存在于胼胝体、扣带回、外囊等脑区，集中在前额叶皮质、海马等重要部位，提示电针能够修复认知功能相关脑区白质纤维损伤。

综上所述，电针百会、神庭可修复VD 大鼠白质纤维束损伤，特别是与学习记忆相关的前额叶、海马等脑区，白质的恢复与认知功能恢复相关。电针非穴和特定穴位对不同脑区白质纤维及认知障碍的影响仍需进一步研究。