环孢素对大鼠睾丸缺血-再灌注损伤后生精细胞凋亡的影响

刘子明 黄定平 朱文平 白培明

厦门大学附属中山医院泌尿外科（福建厦门 361004）

单侧睾丸扭转（unilateral testicular torsion，UTT）起病隐匿，最常见于青少年，25 岁以下男性发病率大约为1/4000，是泌尿男科常见的临床急诊之一[1]。目前临床诊疗的重点主要在于能否早期诊断以及及时手术挽救患侧睾丸，以避免出现睾丸坏死/ 切除的严重后果；但临床观察到仍有相当一部分患者术后患侧睾丸发生萎缩，可能对男性生育产生不利影响[2]。 因此有必要对术后获救睾丸生精功能进行评估并展开进一步治疗措施。 本研究通过建立大鼠UTT 手术模型，探索环孢素对术后睾丸生精功能的保护性影响及其机制， 以期为UTT 临床术后治疗提供基础。

材料和方法

一、实验动物分组

健康SD 雄性大鼠（体重约150-160 g）24 只（购自厦门大学实验动物中心，SPF 级，许可证号：SYXK（闽）2013-0006），随机分为假手术组(S 组)、扭转组（T 组）和环孢素组（C 组），每组8 只。

二、动物模型的建立

睾丸扭转动物模型参照Turner 法[3]建立。乙醚吸入麻醉，消毒，下腹正中小切口，显露左侧睾丸，分离筋膜至附睾头， 扭转组和环孢素组顺时针旋转左侧睾丸720°并维持2h，其间缝合切口。 于复位前15m in 分别腹腔注射生理盐水0.5m L（扭转组）和环孢素（5mg/Kg，环孢素组），其后将扭转睾丸复位并固定于阴囊内。 假手术组扭转720°后立即复位并固定，关切口。 术后24h 快速脱颈椎法处死动物，留取手术侧睾丸。

三、 睾丸组织单细胞悬液制备和流式细胞术（flow cytometry,FCM）分析

取睾丸组织约500 mg 剪碎，0.25% 胰酶37℃水浴消化30 m in；筛网过滤，滤液离心1500g×5 m in 后去上清；PBS 洗涤2 次后加入AnnexinV-FITC、PI 常温避光染色10m in，300 目筛网过滤后上机检测。 流式细胞术试剂盒购自南京建成生物工程研究所。 采用FACSC alibur 流式细胞仪（美国BD 公司）对上述生精细胞单细胞悬液进行定量分析，每份样品检测104个细胞，记录散点图。 在FCM 细胞散点图中，左上区表示坏死细胞群；右上区表示晚期凋亡细胞群；右下区表示早期凋亡细胞群；左下区表示正常细胞群。

四、Fas、FasL mRNA 和Bax mRNA 定量分析

应用qRT-PCR 技术。 用TRIZOL 试剂（生工生物工程有限公司）提取睾丸组织中总RNA。逆转录总反应体系20 μL， 先是2 ug RNA 与1 μL Oligo (dT) 混匀，70℃变性5 m in，冰上放置5 m in，配置逆转录相关的酶和Buffer 共15 μL，并加到5 μL 的RNA 中，25℃5 min，42℃60 m in，70℃15 m in。 按引物设计原则在Genbank中分别设计大鼠Fas、FasL、Bax 基因的上游和下游引物（表1）， 引物由闽博生物科技有限公司提供。 以大鼠β-actin 为内参照。 qRT-PCR 反应体系20 uL，反应条件为：Fas、FasL、Bax、β-actin 94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环40 次。 进行扩增曲线分析。 逆转录试剂盒购自普洛麦格生物技术有限公司；qRT-PCR试剂购自艾德莱生物科技有限公司。 qRT-PCR 最终的定量结果是使用循环数即CT 值，依据2-ΔΔCT 公式计算出各基因与β-actin 的比值。

五、细胞色素C 定量分析

应用Western blot 技术。 组织裂解液裂解大鼠睾丸组织，离心12000rpm×10 m in，收集上清液，BCA 法测定组织蛋白OD 值，通过标准品制作标准曲线，将OD 值代入标准曲线最终求得组织蛋白浓度， 制备蛋白样品保存备用。加5x SDS Loading buffer，混匀样品于100℃水浴锅煮沸10min； 冰上冷却5min，12000rpm 离心10m in，即可点样。 以30 μg 蛋白点样，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转印至PVDF 膜（采用湿转法转膜，转膜条件为95V，60m in）。 5%脱脂奶粉室温封闭1h，兔抗大鼠细胞色素C （1:1000）4℃振荡孵育8 h，1×TBST 漂洗3 次后再加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(1:3000)室温孵育1 h，采用ECL 显色并照相记录结果。 蛋白裂解液和BCA 蛋白测定试剂盒均购自碧云天生物技术研究所。

六、统计学分析

采用SPSS13.0 统计软件分析， 计量资料使用均数±标准差(±s)表示，组间检验采用t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

表1 各基因引物序列

结 果

一、 各组患侧睾丸组织中正常细胞、 早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞、坏死细胞百分比及分布比较

与假手术组相比，扭转组正常细胞群百分比下降，早、晚期凋亡细胞及坏死细胞群百分比升高，其差异具有统计学意义（P＜0.01）；与扭转组相比，环孢素组正常细胞群百分比升高，早、晚期凋亡细胞群百分比下降，其差异具有统计学意义（P＜0.05）见表2，图1。

表2 各组正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞百分比（±s）

表2 各组正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞百分比（±s）

注：与假手术组相比，*P＜0.01；与扭转组相比，#P＜0.05

组别 n 正常细胞（%） 早期凋亡细胞（%） 晚期凋亡细胞（%） 坏死细胞（%）假手术组 8 98.29±0.93 0.57±0.12 0.15±0.04 0.98±0.36扭转组 8 77.81±6.52* 16.74±3.16* 2.63±0.57* 2.79±0.68*环孢素组 8 90.64±7.28# 6.30±1.57# 0.69±0.21# 2.37±0.53

图1 三组左侧睾丸细胞FCM 散点图

二、各组Bax、Fas 和FasL mRNA 的表达以及细胞质中细胞色素C 定量分析

与假手术组相比，扭转组Bax、Fas、FasL mRNA 表达上调，胞质中细胞色素C 含量显著增高，其差异具有统计学意义（P＜0.01）；与扭转组相比，环孢素组Bax、Fas、FasL mRNA 表达下降， 胞质中细胞色素C 含量显著减少，其差异具有统计学意义（P＜0.01）。 见表3，图2和图3。

表3 各组Bax、Fas 和FasL mRNA 表达以及细胞色素C 定量分析（±s）

表3 各组Bax、Fas 和FasL mRNA 表达以及细胞色素C 定量分析（±s）

注：与假手术组相比，*P＜0.01；与扭转组相比，#P＜0.01

组别 n Bax/actin Fas/actin FasL/actin Cytochrome C/β-actin假手术组 8 0.96±0.06 0.97±0.05 1.01±0.05 0.57±0.27扭转组 8 2.39±0.18* 4.52±0.29* 2.82±0.30* 1.40±0.38*环孢素组 8 1.38±0.11# 2.31±0.21# 1.57±0.12# 0.70±0.30#

图2 三组睾丸组织中Bax 、Fas、FasL mRNA 转录水平的变化

图3 三组细胞色素C Western blot 分析

讨 论

目前对睾丸扭转术后患者的随访表明[2,4]，即使外科手术避免了患侧睾丸发生缺血-坏死，获救睾丸术后萎缩率仍达到66.7%，且同时影响生精功能。也就是说，单纯手术治疗效果并不理想。 病理生理学研究已经证实睾丸扭转/复位术后发生的缺血-再灌注损伤是患侧睾丸生精功能受损的主要原因[5]。 这种损伤对睾丸生精功能的影响甚至可能是中长期的， 而且对对侧睾丸生精功能亦可能产生不利影响[6]。 因此，术后如何进一步减轻睾丸生精功能损伤值得研究。

本课题组之前的系列研究已经证实，UTT 术后缺血-再灌注损伤导致患侧睾丸生精细胞群凋亡明显增多[7]，其中单倍体细胞群和四倍体细胞群数量显著减少[8]。也就是说生精细胞凋亡主要发生在精子细胞和初级精母细胞，部分精原细胞亦发生凋亡。 然而当时采用TUNEL 和PI 单染的FCM 技术观察生精细胞凋亡存在一定局限，前者定量精确性欠佳，后者则可能因少量坏死细胞混杂于凋亡细胞群出现在凋亡峰中而难以完美区分。 虽然对研究结果无重大影响，仍有进一步改进的必要。本研究采用AnnexinV-FITC、PI 双染技术，完全区分了正常细胞、早/晚期凋亡细胞和坏死细胞群。 结果表明UTT 术后睾丸生精细胞的损失仍以细胞凋亡为主；虽然扭转组早/晚期凋亡细胞和坏死细胞百分比都较假手术组明显增多，但早期凋亡细胞百分比升高仍是生精细胞损失的最主要原因。 FCM 散点图中可见假手术组的细胞主要集中于正常区； 而扭转组早期凋亡区（右下）细胞分布明显增多。这也和我们以前的研究结论相符。 在应用环孢素干预后，早/晚期凋亡细胞百分比都较扭转组显著下降， 而坏死细胞百分比并无明显变化。 这表明，环孢素早期干预可能通过降低生精细胞凋亡率（而非坏死率），从而减轻UTT 术后生精损伤。虽然限于观察期较短，但其短期疗效仍值得肯定。

UTT 术后生精细胞凋亡过程可能存在着内源性和外源性两条基本途径[8]。 内源性途径以线粒体为中心展开。 通过Bax 介导线粒体渗透性转换孔（mPTP）开放，使线粒体膜间腔内细胞色素C 释放进入胞质[9]，从而启动细胞凋亡程序。 外源性途径则与细胞膜受体系统（如Fas/FasL）激活有关，主要通过配-受体的相互作用转导死亡信号[10]。 两条途径均可通过进一步引起下游Caspase 家族的“瀑布式级联反应”，相继激活Caspase-8/9和Caspase-3，诱导生精细胞发生凋亡[11]。

环孢素对于细胞凋亡内源性线粒体途径的影响在不同器官缺血-再灌注损伤研究中已得到证实。 董建新等[12]发现环孢素抑制线粒体渗透性转换孔开放，减轻了兔小肠缺血-再灌注损伤。 王为等[13]在观察二硫化碳对大鼠睾丸细胞凋亡的影响时发现， 细胞凋亡线粒体通路相关蛋白的表达可能与环孢素的干预有关。 本研究显示，环孢素干预后Bax mRNA 表达下调，同时胞质中线粒体释放的细胞色素C 含量降低， 表明环孢素可能通过抑制细胞凋亡的线粒体途径减少UTT 术后生精细胞凋亡。 有意思的是，环孢素可能也同样影响了细胞凋亡的膜受体途径。 本实验中环孢素干预后Fas/FasL mRNA 表达下调，必然会降低细胞凋亡信号的转导，降低细胞凋亡水平。 Baky 等[14]发现环孢素能通过降低FasL 水平发挥显著的细胞保护性效应。 王刚等[15]在心肌缺血-再灌注模型中亦发现环孢素预处理能有效减少Fas/FasL 蛋白表达，延缓心肌细胞缺血再灌注损伤，具有保护心肌细胞作用。 这也就是说，环孢素可能通过调控多种凋亡相关基因的表达， 同时对内源性和外源性凋亡信号途径产生影响，减少UTT 术后生精细胞凋亡，降低睾丸生精损伤。 环孢素的类似作用在其他细胞凋亡研究中亦得到证实[16]。

本研究仍存在不足之处。虽然实验结果显示环孢素对大鼠UTT 手术模型术后生精功能存在保护性作用，但限于观察期较短，其长期影响仍有待于进一步探讨。