牙周炎基因疫苗pVAX1⁃HA2⁃FimA、pVAX1⁃HA2⁃FimA/IL⁃15对大鼠实验性牙周炎保护作用研究

于 航 ，杨智强，曾凤娇，陈 靖，刘建国，白朋元，白国辉*

1遵义医科大学口腔学院，贵州 遵义 563000；2贵州省普通高等学校口腔疾病研究特色重点实验室，贵州 遵义 563000；3贵阳市第二人民医院口腔科，贵州 贵阳 550081

牙周炎发病率高且危害性大，严重影响着人类口腔健康，且与全身疾病也有着密切的关系［1］。第四次全国口腔流行病学调查显示，35～44岁居民中，96.7%人群口腔内存在牙结石，87.4%有牙龈出血症状，与10年前相比，上升了10.1个百分点［2］。牙周炎是一种慢性非特异性炎症，对牙周组织的损害是持续不可逆的，因此对牙周炎的提前预防显得尤为重要［3］。本课题组前期采用牙龈卟啉单胞菌（Porphy⁃romonas gingivalis，P.gingivalis）表面的毒力因子菌毛蛋白A（fimbrillin，FimA）和血凝素2（hemagglutinin⁃2，HA⁃2）的编码基因作为目的基因，以白介素（IL）⁃15作为免疫佐剂，成功构建牙周炎基因疫苗pVAX1⁃HA2⁃FimA、pVAX1⁃HA2⁃FimA/IL⁃15［4］。本实验将2种基因疫苗通过鼻腔黏膜免疫方式作用于SD大鼠，评价其对SD大鼠实验性牙周炎的免疫保护作用。

1 材料和方法

1.1 材料

牙周炎基因疫苗pVAX1⁃HA2⁃FimA/IL⁃15、pVAX1⁃HA2⁃FimA（本课题组前期构建），由贵州省普通高等学校口腔疾病研究特色重点实验室保存。SD雄性大鼠［第三军医大学野战外科研究所动物室，质检单位：重庆市实验动物质检中心，许可证号：SCXK（渝）2012⁃0005］。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及免疫

54 只5～6 周龄、体重（180±30）g 健康雄性SD 大鼠，采用随机数字法分为9 组，每组6 只，适应性喂养大鼠1 周。对照组：A组：生理盐水组；B组：空载组；C组：牙周病组（炎性对照组）。实验组：D组：50 μg pVAX1⁃HA2⁃FimA组；E组：100 μg pVAX1⁃HA2⁃Fi⁃mA组；F组：150 μg pVAX1⁃HA2⁃FimA组；G组：50 μg pVAX1⁃HA2⁃FimA/IL⁃15 组；H 组：100 μg pVAX1⁃HA2⁃FimA/IL⁃15组；I组：150 μg pVAX1⁃HA2⁃FimA/IL⁃15 组。免疫剂量：100 μg（1 000 μg/mL）；免疫时间：每隔1周免疫1次，首次免疫后，加强免疫2次，共免疫3次；免疫方法：双侧鼻腔黏膜免疫，每次滴注后直立大鼠1 min，隔5 min滴注1次。

1.2.2 建立牙周炎模型

最后1次免疫后1 d，4.0丝线结扎大鼠上颌第二磨牙，丝线伸入龈沟，采用眼科细剪，划入龈沟，划入深度1 mm，割破牙龈。每周检查缝线脱落情况。

1.2.3 立体显微镜观察并测量牙槽骨吸收量

牙周炎模型建立后第8 周处死大鼠，解剖分离上颌骨，修整颌骨。将上颌骨于NaOH 溶液中加热5 min，去除软组织。于立体显微镜下观察上颌第二磨牙牙槽骨吸收程度并拍照，设定1 mm标尺，以标尺长度为参照标准，测量上颌第二磨牙颊腭侧近中、中央、远中6个位点牙槽嵴顶至釉牙骨质界的距离，以6个位点测量值的均值作为牙槽骨吸收量。

1.2.4 RT⁃qPCR 检测上颌第二磨牙牙龈组织中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor⁃α，TNF⁃α）、基质金属蛋白酶8（matrix metalloproteinase⁃8，MMP⁃8）的表达量

牙周炎模型建立后第8 周处死大鼠，取大鼠上颌第二磨牙牙龈组织，提取牙龈中总RNA，逆转录为cDNA，TNF⁃α、MMP⁃8及β⁃actin引物均由日本Ta⁃KaRa公司设计合成（表1），3种引物均是25 μL反应体系，β⁃actin引物退火温度53 ℃，TNF⁃α、MMP⁃8引物退火温度60 ℃，2-ΔΔCT计算目的基因相对表达量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 统计学方法

实验数据用SPSS18.0 软件中方差分析对数据进行统计分析，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 立体显微镜下测量SD大鼠上颌第二磨牙牙槽骨吸收量

A、B 组大鼠上颌第二磨牙未见明显牙槽骨吸收，C 组可见颊腭侧近中、中央、远中共6 点均有明显的牙槽骨吸收，实验组D、E、F、G、H、I均有部分牙槽骨吸收；各组牙槽骨吸收量见图1。C 组较A、B、D、E、F、G、H、I组牙槽骨吸收量高，差异有统计学意义（P＜0.01）；A、B 组差异无明显统计学意义（P＞0.05）；A、B 组较D、E、F、G、H、I组牙槽骨吸收量低，差异有统计学意义（P＜0.05，图2）。

2.2 RT⁃qPCR法检测牙龈组织TNF⁃α、MMP⁃8的表达

2.2.1 目的基因扩增的熔解曲线

β⁃actin、TNF⁃α、MMP⁃8熔解曲线图见图3，熔解曲线图观察到样本均无引物二聚体及非特异扩增峰，目的基因各峰值一致，说明引物设计合理，特异性高。

2.2.2 RT⁃qPCR 牙龈组织TNF⁃α、MMP⁃8 mRNA 的表达量

统计结果显示，C 组较A、B、D、E、F、G、H、I 组TNF⁃α、MMP⁃8 mRNA相对表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.01和P＜0.05，图4、5）。H组较E组TNF⁃α mRNA 表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；D 组较G 组、F 组较I 组TNF⁃α mRNA 表达水平无差异（P＞0.05）。D 组较G 组MMP⁃8 mRNA 表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05），H 组较E 组，F 组较I 组MMP⁃8 mRNA 表达水平无差异（P＞0.05）。

3 讨论

牙周炎因其高发生率及高危害性而逐渐引起人们的重视。目前牙周炎的治疗方法包括基础治疗、手术治疗等，但现有的治疗方式并未取得理想的效果，因此关于牙周炎的预防显得尤为重要。牙周炎的发生与口腔微生物群的失调有关，预防微生物的聚集、牙菌斑形成，将为牙周炎的预防提供基础策略。牙周炎基因疫苗的构建思路是通过寻找与牙周炎密切相关的致病菌的有效抗原结构，利用其相关基因的片段通过基因工程的方法构建共表达的重组基因片段［5］，然后通过载体的作用转移到宿主体内，并表达出相对应的蛋白质作为有效抗原，刺激机体的免疫反应，产生相应抗体。当细菌病原体再次进入机体内时，可以迅速引起机体产生抗原抗体反应，抑制致病菌的黏附或致病菌毒力因子的作用，从而达到预防牙周炎的效果。

牙龈卟啉单胞菌是公认的与牙周炎发生发展有着密切关系的致病菌，以牙龈卟啉单胞菌的毒力因子疫苗备选的目的基因有多种，Sharma 等［6］利用牙龈卟啉单胞菌的毒力因子fimA 制成的基因疫苗，有效抑制了因牙龈卟啉单胞菌引起的牙槽骨丧失。Miyachi 等［7］使用rpgA 制作DNA 疫苗，通过基因枪经腹和鼻腔两种途径免疫小鼠，结果表明，鼻腔免疫途径的小鼠体内产生了IgG 和sIgA，并能有效控制感染了牙龈卟啉单胞菌所造成的牙槽骨丧失。牙周炎是多致病菌引起的炎症性疾病，各致病菌的毒力因子亦有多种，目前相关研究中，关于牙周炎基因疫苗多以构建单个目的基因为主，关于多基因联合构建重组质粒还鲜有报道。因此构建高效表达的多基因组合共表达质粒是当前研究的热点，也是难点［8］。

单纯包含目的基因的裸质粒疫苗免疫后产生的抗体水平低，持续时间短，人们便考虑使用不同的佐剂以便提高抗原的免疫原性及耐受性等。目前用于疫苗工程中的佐剂主要包括蛋白类、核酸类、混合佐剂等。佐剂的加入能够增强抗原对于细胞的渗入性、防止抗原降解，增强抗原的呈递作用，从而提高抗体水平，以及延续抗体作用时间，因此佐剂的选择也显得十分重要。IL⁃15 是一种Th1 型细胞因子，在免疫中能够协同其他细胞因子，促进Th1型免疫应答的发生。有学者认为牙周炎的病例过程与Th1/Th2 主导的平衡状态有关，牙周炎早期以及静止期表现为Th1 型，而Th2 倾向则提示牙周严重破坏。IL⁃15 作为佐剂联合基因疫苗使用的实验已有学者报道，加入IL⁃15 的基因疫苗经鼻黏膜免疫能够诱导更高的SIgA，并且无不良反应［9-12］。

本实验组通过以牙龈卟啉单胞菌的主要毒力因子菌毛蛋白fimA以及牙龈素⁃血凝素基因编码区的核心功能区HA2 的目的基因联合构建多基因联合疫苗，并以IL⁃15 作为佐剂。通过实验发现各实验组牙龈组织中炎症因子TNF⁃α、MMP⁃8 mRNA 低于炎性对照组。表明牙周炎基因疫苗成功诱导了大鼠体内的有效免疫反应，抗体的高水平表达能够有效预防SD大鼠实验性牙周炎。因此，应用牙周炎基因疫苗pVAX1⁃HA2⁃FimA、pVAX1⁃HA2⁃FimA/IL⁃15通过鼻黏膜免疫大鼠，对实验性牙周炎起到了明显的防御保护作用，为牙周炎基因疫苗应用于临床的研究奠定了基础。