RBM7在乳腺癌细胞BT474中的表达及其与P21的关系

奚佩雯，胡 玥，张 旭，戴欣媛，石 靓，丁 强

南京医科大学第一附属医院乳腺病中心，江苏 南京 210029

近年来，随着对RNA 结合蛋白（RNA binding protein，RBP）的结构和功能的研究逐步深入，人们发现RBP 与多种疾病密切相关［1］，并且在癌症的发生发展中扮演着重要的角色［2］。RBP通过影响不同靶基因mRNA的稳定性，从而在转录后的调节中发挥作用。RBP的表达突变和靶基因中的结合位点改变涉及多种人类疾病。RNA结合蛋白7（RNA bind⁃ing protein 7，RBM7）基因，是以RNA识别基序（RRM）为主要结构的RBP 家族中的重要成员之一［3-4］。目前，RBM7 主要参与人源性三聚体核外靶向复合物（NEXT）的构成；且作为NEXT 中的关键组分，与hMTR4 和锌指蛋白ZCCHC8 两者相互结合，从而发挥其生物学功能［5-7］。有研究结果显示，RNA结合蛋白38（RNA binding protein 38，RBM38）可以结合P21的3′端非编码区（untranslated regions，UTRs）的富含AU 区（AU⁃rich elements，AREs），从而稳定P21 的mRNA，诱导细胞周期停滞在G1期［8］。

P21，也称CDKN1A，作为细胞周期依赖性蛋白激酶（CDK）的抑制剂，是细胞周期中的重要调控因子；可与CDK1和CDK2相互联系，在细胞周期的G1期中发挥作用［9-10］。P21 的过表达可以抑制哺乳动物细胞的增殖，从而调控肿瘤细胞的生长环节。通常，P21作为癌症相关基因的作用靶点，直接或者间接参与到癌症的复杂过程中。

本研究将外源性RBM7基因稳定转入人源性乳腺癌细胞株BT474 中，并构建稳定转染的RBM7 过表达及干扰细胞株。通过细胞学功能研究发现RBM7 对乳腺细胞周期产生影响，更进一步探索发现，RBM7 能够调节细胞周期关键因子P21 的表达。深入机制研究发现，RBM7 能与P21 的转录子直接结合并发挥其生物学作用。

1 材料和方法

1.1 材料

人源性乳腺癌细胞株BT474 由本实验室保存。胰酶（上海Beyotime 公司）；DMEM（上海Wisent 公司）；胎牛血清（FBS，上海Fcmacs公司）；慢病毒转染试剂（上海吉玛公司）；RNA TRIzol、PrimeScript RT Reagent 试剂盒、SYBR Premix Ex Taq 试剂（TaKaRa公司，日本）；小鼠抗人β⁃actin 单克隆抗体（上海Beyotime公司）；兔抗人RBM7多克隆抗体（上海Ab⁃cam 公司）；兔抗人P21 抗体（Cell Signal Technology公司，美国）；辣根过氧化物酶（HRP，Millipore公司，美国）；增强型化学发光试剂（ECL）蛋白印迹底物（上海Thermo 公司）；青、链霉素（上海HyClone 公司）。细胞周期检测试剂盒（上海联科生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

BT474 细胞株培养于含10%FBS、1%青霉素和链霉素的DMEM 培养液中，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中，胰酶消化传代。

1.2.2 细胞转染

培养BT474细胞株，当细胞生长至对数生长期，融合至70%左右时，用胰酶消化细胞，按30万个/孔的细胞量铺入6孔板中，铺板18 h后细胞贴壁，进行转染，参照慢病毒转染试剂说明书分别设过表达RBM7的实验组（RBM7）和对照组（NC），干扰RBM7的实验组（Sh⁃1和Sh⁃2）和对照组（SCR）。

1.2.3 筛选稳定细胞株

细胞转染48 h后换为含1 μg/μL嘌呤霉素的完全培养基筛选细胞株，嘌呤霉素浓度逐步加至3 μg/μL，2周后选出稳定表达的抗性克隆细胞株保种、传代［11］。

1.2.4 定量即时聚合酶链锁反应（qRT⁃PCR）检测RBM7基因的mRNA表达水平

引物由上海Invitrogen 公司合成。取对数生长期的细胞，按TRIzol 试剂说明书提取总RNA，Prime Script RT Master Mix Perfect Real time 合成cDNA（37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃延伸）。使用SYBR Pre⁃mix Ex TaqTM试剂，反应体系20.0 μL，SYBR 10.0 μL，前后引物10 mol各0.8 μL，cDNA 2.0 μL，灭菌蒸馏水6.0 μL，ROX 0.4 μL。反应条件：预变性95 ℃30 s；变性95 ℃5 s，退火60 ℃30 s，共40 个循环（Step One PlusTMReal⁃time PCR System）。计算2-△△Ct值为RBM7基因的相对表达量。

PCR 反应引物序列如下所示：内参β⁃actin：正义5′⁃TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA⁃3′；反义5′⁃CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG⁃3′。RBM7：正义5′⁃GAAGCGGATCGCACTCTCTTT⁃3′；反义5′⁃CACAAACGCAAACTGCTTTGG⁃3′。P21：正义5′⁃TAAGGACTGAGAAATGAAAGTGGA⁃3′；反义5′⁃GAGCTTAACTAAATAATAGCCCAATAC⁃3′。

1.2.5 Western blot检测蛋白表达

按照蛋白提取试剂盒说明书要求提取待测细胞的总蛋白。蛋白样品加至SDS⁃PAGE凝胶电泳2 h后转至硝酸纤维素膜（PVDF）上，5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h，分别与一抗RBM7（1∶500 稀释）、P21（1∶1 000 稀释）和β⁃actin（1∶1 000 稀释）在4 ℃摇床内孵育过夜，TBST 漂洗3次，每次10 min，二抗（1∶1 000 稀释）室温孵育2 h，TBST 漂洗3 次，每次10 min。β⁃actin作为内参对照。Western blot结果用凝胶成像仪扫描，用Image⁃ProPlus 6.0软件分析，实验重复3次。

1.2.6 流式细胞周期实验

胰酶消化收集细胞，预冷PBS 洗3遍，75%乙醇固定，4 ℃冰箱过夜，避光加入400 μL DNA staining solution 后涡旋振荡5～10 s 混匀。室温避光孵育30 min，使用流式细胞计数仪分析其细胞周期分布情况［12］。

1.2.7 CCK⁃8实验

细胞以2 000 个/孔的密度接种在96 孔板中，设置只含有培养液的空白对照孔。细胞使用完全培养基连续培养6 d，选取固定的时间点每天进行检测。检测前吸尽孔中的旧培养液，以100 μL/孔的量加入CCK⁃8混合液，继续在培养箱中孵育。2 h后使用酶标检测仪在450 mm的波长下测量吸光度，获得吸光度值。

1.2.8 RNA结合蛋白免疫共沉淀（RIP）

将人乳腺癌细胞BT474（2×107个）用RNA 免疫沉淀裂解缓冲液（Millipore公司，美国）裂解，离心取上清，在4 ℃下分别与5 μg 抗兔RBM7 抗体和抗兔非特异性IgG摇床孵育过夜。待抗体与RNA以及磁珠结合后沉淀为复合物，并对沉淀下来的复合物进行RNA 纯化。之后，将纯化的RNA 进一行qRT⁃PCR、RT⁃PCR 及琼脂糖电泳实验［13］。用于检测P21和β⁃actin 的引物序列同前。

1.3 统计学方法

应用SPSS22.0 统计软件分析，结果以均数±标准差（）表示。使用t检验比较两组独立样本；使用方差分析比较组间差异。实验均进行3 次重复，P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结果

2.1 在乳腺癌细胞BT474 中构建稳定的RBM7 过表达及干扰细胞株

首先构建了RBM7 过表达及干扰慢病毒，并分别转染入人乳腺癌细胞BT474 中。转染24 h 后，我们开始用嘌呤霉素筛选细胞，用量由1 μg/μL 逐步加至3 μg/μL，以获得稳定转染的细胞株。转染48 h后，在荧光显微镜下可观察到细胞带有绿色荧光，荧光效果较弱（图1A）。经过14 d 的嘌呤霉素抗性筛选，细胞在嘌呤霉素环境下稳定生长并传代3次，获得稳定表达RBM7 的带抗性的BT474 细胞，在荧光显微镜下可观察到细胞带有绿色荧光，荧光表达较前明显增强（图1B）。然后，通过qRT⁃PCR 和Western blot 实验发现，在过表达RBM7 的实验组（RBM7）和对照组（NC）之中，与对照组相比，实验组RBM7 的RNA 和蛋白表达水平明显增高，差异有统计学意义图（P＜0.05，图2A、B）；同时，在干扰RBM7的实验组（Sh⁃1和Sh⁃2）和对照组（SCR）中，实验组RBM7的mRNA和蛋白表达水平明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05，图2C、D）。

2.2 RBM7表达改变影响乳腺癌细胞的增殖

用上述构建的细胞株进行功能实验，通过CCK⁃8 实验发现，RBM7 过表达组（RBM7）的细胞增殖速度明显快于对照组（NC），而RBM7 干扰组（Sh⁃1 和Sh⁃2）的细胞增殖速度明显慢于对照组（SCR），差异有统计学意义（P＜0.05，图3A、B）。通过流式细胞周期实验发现，RBM7过表达后的G1期细胞数百分比明显减少，而S 期和G2 期细胞数百分比显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05，图3C、D）；而RBM7 干扰组（Sh⁃1 和Sh⁃2）较对照组（SCR）相比，G1 期的细胞数百分比明显增加，而S 期和G2 期的细胞数百分比有所下降，差异有统计学意义（P＜0.05，图3E、F）。这说明过表达RBM7可以诱导细胞周期的进程加快，而干扰RBM7 则可以抑制细胞周期的进程。

2.3 RBM7表达改变对P21的mRNA和蛋白表达的影响

qRT⁃PCR 和Western blot 结果显示，过表达RBM7 后，P21 的mRNA 和蛋白表达水平明显降低，差别有统计学意义（P＜0.05，图4A、B）；干扰RBM7后，P21的mRNA和蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05，图4C、D）。

2.4 RBM7能直接结合P21的转录子

基于上述所描述的RBM7 与P21 表达的相关性，本研究进一步通过RIP 实验研究了RBM7 调节P21 表达的机制，将RIP 实验获得的mRNA 进一步行qRT⁃PCR 实验，结果显示在实验组、空白对照组和阴性对照组之中，实验组（RBM7）的P21的mRNA表达水平较阴性对照组（IgG）的明显增高，差异有统计学意义（图5A）。同时琼脂糖凝胶电泳实验，结果显示加RBM7 抗体复合物的实验组中有P21 的表达，而加IgG 抗体复合物的阴性对照组中无P21 的表达。作为阳性对照，RBM7不能与β⁃actin结合（图5B）。这些研究结果表明RBM7 能直接结合P21 的转录子，从而调节P21的表达。

3 讨论

RBP 主要在转录后的基因表达调控中发挥作用，对肿瘤的发生发展具有重要意义［14-15］。具体来说，RBP 直接结合RNA 的非翻译区（UTR），并涉及RNA加工的各个方面，例如RNA定位、多腺苷酸化、剪接、转运、稳定性和翻译等，从而参与到细胞过程中［16］。所有的RBP 均可与RNA 结合生成核糖核蛋白复合物（ribonucleoprotein complexes，RNP），且不同的RBP 具有不同的RNA 序列特异性、亲和力［17］。RBP 影响着RNA 的结构、RNA 与RNA 之间的相互联系，并且在RNP中发挥着关键作用。几乎所有类型的RBP 都直接或间接地参与到蛋白质的翻译过程中［18］。

RBP 通过多种机制调控翻译，包括与核糖体竞争RNA、直接结合mRNA 和诱导核糖体捕获等［19］。其中，RBP直接结合mRNA较普遍，是将遗传信息从转录组传递到蛋白质组的关键点。RBP覆盖mRNA形成的结合物作为翻译过程中所需的底物［20-21］。RBP 的3′⁃UTR 属于非编码部分，含有序列特异性RBP 结合的顺式作用元件。3′⁃UTR 既是mRNA 的稳定性、细胞内定位和翻译的调节元件的储存库，又可以像长的非编码或小RNA 一样发挥作用［22］。RBP 激活或抑制翻译过程，且大多数已知的实例是RBP通过与靶mRNA的3′⁃UTR结合来发挥作用的，这有助于实现基因表达调控的局部功能化、区域化以及协调一致性［23］。

本研究中的RBM7 既是RBP 的成员之一，又作为人源性三聚体核外靶向复合物（NEXT）的关键组成部分，其主要通过RNA 识别基序（RRMs）与mRNAs中富含尿苷的序列特异性结合从而在NEXT中发挥重要作用［24］。目前，人们主要关注RBM7 在NEXT 中的结合方式和作用，然而其在肿瘤中的具体作用机制尚未可知。

众所周知，肿瘤的发生发展在一定程度上涉及细胞周期及凋亡等过程的改变［25］。本研究中CCK⁃8和流式细胞周期实验结果均表明，人源性乳腺癌细胞BT474 中过表达RBM7 可促进乳腺癌细胞的增殖，同时加速细胞周期的进程；而干扰RBM7则可抑制乳腺癌细胞的增殖，同时阻碍细胞周期的发展。细胞周期涉及众多因子共同作用，其中P21 起主要抑制作用，通过与细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1和CDK2结合，介导多种生物活性，从而诱导细胞周期进程的停滞。P21 在许多肿瘤中都低表达，并且P21 低表达与较大的肿瘤形成以及较差的生存情况都有一定的关联性。P21 可与增殖细胞核抗原（PCNA）结合，进而干扰PCNA 依赖性DNA 聚合酶活性，抑制DNA 复制，调节各种有PCNA 依赖性的DNA 修复过程［26-27］。相关研究表明，转录后调控是P21 表达调控的重要方式之一，许多RNA 结合蛋白都被报道可以调节P21的稳定性。如紫外线暴露后的HUR 通过结合P21 mRNA 的3′⁃UTR 区来提高其稳定性；RBM38通过结合P21 mRNA的3′⁃UTR区发挥促癌作用；RBMS2 结合P21 mRNA 的3′⁃UTR 区，从而增加了P21的表达并发挥抑癌作用等［28］。

本研究中探索了人乳腺癌细胞BT474中RBM7的表达改变对P21 表达的影响。初步认为，RBM7与P21 的表达在人乳腺癌细胞BT474 中呈负相关，RBM7 过表达可以抑制P21 的mRNA 和蛋白的表达。通过RIP 实验，进一步研究证实了在人乳腺癌细胞BT474 中RBM7 直接结合P21 的mRNA 从而发挥其负性调节作用。

综上所述，RBM7 在人乳腺癌细胞BT474 中可以通过直接结合细胞周期关键因子P21的mRNA从而抑制P21 的表达并发挥其对细胞周期的作用，而RBM7在乳腺癌中发挥作用的具体分子机制以及是否涉及调控其他靶基因的表达目前尚不明确，有待后续深入研究。