支撑物对试管内蓝莓组培苗生根的影响

郭茹，孙世海，叶霞，华仁锐

(天津农学院，天津 300384)

蓝莓(Vacciniumuliginosum)属于杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)，为落叶或常绿灌木，是一个既古老又新兴的果树树种[1]。原产于北美，美国大西洋沿岸各州和加拿大东南部都有分布[2]。 蓝莓的繁殖方法较多，总体分为有性繁殖和无性繁殖，有性繁殖主要是实生播种，缺点是容易发生性状分离；无性繁殖的方法主要以扦插繁殖为主，其他方法有分株繁殖、组培繁殖、嫁接繁殖等[3]。自20世纪80年代开始，蓝莓种植传入中国，引种规模日益扩大，种苗生产供不应求[4]。采用植物组织培养技术可以规模化生产，减少成本，提高繁殖系数，短期之内可获得大量的无病毒苗木，保持品种的优良性[5，6]。目前蓝莓植物组织培养快繁技术相对比较成熟。蓝莓属于木本植物，在繁殖种苗过程中会出现生根难的问题，严重制约蓝莓产业化的发展。如何提高蓝莓的生根率和缩短蓝莓生根时间已成为蓝莓组培技术研究的重要内容。琼脂是一种高分子碳水化合物，从海藻中提取。传统的培养基中，琼脂仅仅是一种固化剂，作为凝固剂使用，不具任何营养[7]。到目前为止，还没有发现更好的可取代琼脂的支持物。本研究通过以蓝莓组培苗为试验材料，改变培养基中的支撑物，添加不同浓度的激素，从而筛选出最佳生根培养基，为蓝莓产业化发展提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

取继代培养40 d、芽高3 cm以上且生长健壮的组培芽为接种材料，草炭、珍珠岩均采自均购自朝日物产(天津)园艺科技股份有限公司，珍珠岩用自来水淘洗3遍后烘干备用。

1.2 试验方法

选择生长健壮且大小基本一致的组培苗接入到不同的培养基中，即4因素3水平正交试验[L9(34)]设计的诱导生根培养基(表1)。实验设9个处理，每个处理接种20瓶，每瓶接入2株，共计40株。培养基pH5.2±0.1。

以大口瓶为培养瓶，草炭、珍珠岩的用量每瓶均为8 g，再加入基础液体培养基40 mL，各处理支撑物及相应液体培养基分装后，置于121 ℃灭菌20 min。处理7、处理8和处理9，先在培养瓶中加入30ml只含有琼脂的液体，然后进行常规灭菌，取出待其在室温下冷却凝固后，在超净工作台前加入30 mL的基础液体培养基。接种后培养室内培养，培养温度23±2 ℃，光照强度2 000 lx，光照时间12 h。

用Microsoft Excel完成对数据及图表的基本处理，采用SPSS17.0软件进行数据分析。

1.3 调查统计

接种70 d后调查组培苗的株高、叶片数、根长及平均根长，并计算生根率及有效生根率。计算公式：生根率=生根株数/总接种数×100%，有效生根率=生根株数(每株根数≥3)/总接种数×100%。

表1 蓝莓组培苗诱导不定根L9(34)正交试验设计

注：A: 支撑物类型 B:基础液体培养基类型 C:激素类型D:激素浓度(mgL-1)，其中纯琼脂指用蒸馏水融化琼脂后灭菌冷凝作为固体支撑物，IBA+NAA指IBA与NAA浓度各占1/2

表2 正交试验组合方案

2 结果与分析

2.1 蓝莓组培苗试管内生根各处理间的比较

选取生长健壮且大小一致的蓝莓试管芽接种于不定根诱导培养基上，接种7 d后调查污染率，接种15 d后观察生长状况，70 d调查生根率、有效生根率及株高和叶片数，详见表3。

表3 各处理试管内生根观测结果

诱导不定根的数量和不定根生长速度随培养基不同而异。接种20 d后，处理7在愈伤处开始逐渐长根，处理8有少数长根，处理9只有极少数根，其他处理由于支撑物的不同，观察不到生根的情况。接种70 d后对其生根率、株高、叶片数等进行数据统计分析，调查蓝莓组培苗在9个不同处理中的生根情况。组培苗的生根率从0到92.5%，有效生根率从0到82.5%，株高3.39～7.78 cm，平均单株叶片数4.93～14.75片。其中以草炭作为支撑物的处理4、处理5以及处理6都没有生根且叶片泛黄；珍珠岩作为支撑物的处理1、处理2和处理3的组培苗长势健壮，且生根率及有效生根率均高于以纯琼脂作为支撑物的处理7、处理8和处理9。其中处理1和处理2的叶片是绿色的，处理3的叶片稍微泛黄，处理7的叶片呈绿色，处理8的叶片呈淡绿色，处理9叶片呈黄色；处理1和处理2的根与其他处理相比，根系粗壮且长，处理3的根相对较细且多。处理1和处理7的根部几乎不形成愈伤组织，处理2和处理3的根部有明显愈伤组织的形成；用纯琼脂作为支撑物的处理8和处理9生根率低且分支少。处理7、处理8以及处理9的根大部分长在与基础液体培养基接触的茎的周围，处理1、处理2和处理3大多是在切口处长根。

2.2各处理有效生根率的统计分析

根据各因素的极差值来分析其对蓝莓组培苗瓶内生根的影响程度，R值越大影响就越显著。见表4。

支撑物类型 、基础液体培养基类型、激素类型和激素浓度四个因素对蓝莓组培苗瓶内生根效应的大小依次是支撑物类型>基础液体培养基 >激素类型=激素浓度。四个因素中，支撑物类型对瓶内生根的影响最大，R值为83.33；激素类型和激素的浓度对诱导瓶内生根的影响最小，且R值相同，都为10。每一因素水平下的数据平均值反映了影响因素各水平对反应体系的影响情况，Ki值越大反应水平越好，因此，诱导蓝莓组培苗瓶内生根最优因素水平为：将蓝莓组培苗接种于以珍珠岩作为支撑物，基础液体培养基为WPM，添加1 mgL-1的IBA+NAA的培养基。

表4 有效生根率的极差分析

表5 有效生根率的方差分析

由表5可知，各支撑物有效生根率差异极显著，支撑物类型对蓝莓组培苗瓶内生根影响最大，这与极差分析结果一致。基础液体培养基(B)、激素类型(C)和激素浓度(D)各水平有效生根率差异不显著。因而还须进行支撑物类型(A)各水平有效生根率的多重比较。详见表6。

表6 不同支撑类型的蓝莓试管苗有效生根率多重比较

各效应显著测验中，支撑类型(A)3个水平处理的差异极显著，珍珠岩的有效生根率极显著高于纯琼脂和草炭的有效生根率。基础液体培养基、激素类型和激素浓度有效生根率差异不显著，最优水平可选有效生根率最高的WPM、IBA+NAA和1 mgL-1。于是最优水平组合是：以珍珠岩为支撑物，基础液体培养基为WPM，添加浓度为1 mgL-1的IBA+NAA。

3 结论与讨论

组培苗的生根能力受植物材料、基本培养基、培养条件和植物激素等因素的影响，其中植物激素对组培苗的生根能力起着决定性的作用，因此激素的种类及其浓度成为蓝莓生根的研究热点，且不同的研究者有不同的研究成果。传统的培养基中，以琼脂作为凝固剂使用，以作固体培养用。到目前为止，还没有发现更好的可取代琼脂的支持物。本试验除了探讨基本培养基类型、激素种类和浓度以外，用草炭和珍珠岩取代琼脂作为支撑物，进行蓝莓组培苗生根研究。本试验研究认为，通过以草炭作为支撑物的处理4、处理5和处理6的数据研究表明，草炭作为支撑物完全不适合蓝莓组培苗的生根。其可能的原因是，草炭由有机质和矿物质组成，其本身就含有丰富的营养成分；优点是保水保肥性好，缺点是透气性较差。所以用草炭作为支撑物，可能是培养基中过盛的营养以及较差的透气性导致蓝莓组培苗完全不生根且抑制其生长。通过以珍珠岩作为支撑物的处理1、处理2和处理3的数据研究表明，珍珠岩作为支撑物，其长势和生根率均明显优于其他处理，且处理1几乎没有愈伤组织的形成，移栽成活率较高。处理7、处理8和处理9，以琼脂作为支撑物，添加液体培养基，采用液体培养，其生根位置在与液体表面接触的茎的周围，其根悬浮在液体表面，形成的愈伤组织相对较少。通过正交试验，能够有效地减少不同因素之间的不同组合，并且还能够有效地利用极差和方差的因素进行分析，从而提高对于蓝莓组织培养有效因素的获得。综上所述，用珍珠岩代替琼脂作为支撑物，WPM培养基中加入0.5 mgL-1IBA和0.5 mgL-1NAA可以作为蓝莓品种蓝丰组培苗生根的培养基。