梅山猪耳成纤维细胞系的建立及生物学特性分析

张宏丽，葛 雷，吴彩凤，张树山，张德福，戴建军*，孙玲伟

(1上海海洋大学水产与生命学院，上海201306；2上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海市农业遗传育种重点实验室动物遗传工程研究室，上海201106)

我国地方猪种资源十分丰富，且拥有很多独特的遗传特性，受到国内外育种者的高度重视。由于各种原因，有些地方猪种数量急剧下降，甚至绝种，需要应用各种技术来保存地方猪种种质资源。畜禽遗传资源保存的方法有活体动态保存和静态保种，静态保种包括配子、精子和胚胎的超低温冷冻保存和DNA文库保存。体细胞冷冻因简单、有效和更具可操作性，且采集时不影响动物健康，受到越来越广泛的重视，其在优良种畜资源保种和濒危物种保种中具有广泛的应用前景[1]。

梅山猪是我国一个优良的地方品种，以繁殖力高、使用年限长和肉质鲜美而著称[2-3]。为保存梅山猪猪种种质资源，本研究采用组织块培养法建立了梅山猪耳成纤维细胞系，并对所建细胞系进行生物学特性研究，以期使这一优良资源得到保护，也为其他动物保种提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验动物

梅山猪耳缘组织采自上海嘉定区梅山猪育种中心。

1.2 主要试剂

无特殊说明外，所有培养用液体均为Gibco公司产品，生化试剂均为Sigma公司产品。

1.3 耳成纤维细胞原代培养、传代、冻存及复苏

原代培养(G0代)：耳部边缘剪毛清洁后，用酒精棉球多次消毒，无菌剪取3 mm×4 mm的组织块，放入含1 000 IUmL双抗的D-Hanks液中，4 ℃保存，2 h内带回实验室。用手术刀片刮去耳缘组织外部表皮组织，D-Hanks液冲洗3次。将组织块转移到青霉素小瓶中，灭菌剪刀剪至糊状后均匀地铺在T-25培养瓶的底壁，翻转后加入5 mL细胞培养液(DMEM+10% FBS+100 IU双抗+1%丙酮酸钠)，置于CO2培养箱中贴壁孵育。孵育6—8 h后将培养瓶轻轻翻转，使细胞培养液慢慢浸没组织块，静置培养。培养过程中每3天换1次液，换液时尽量避免组织块悬浮。

传代：当细胞汇合至80%—90%时，去掉原培养液，D-Hanks液清洗2次，加入2 mL 37℃预热的0.25%胰酶，消化2 min，加入2 mL细胞培养液终止消化，离心重悬浮，按1∶2的比例分瓶，放入37℃、5% CO2和 100%湿度的培养箱继续培养。

冻存：待培养的细胞汇合至80%—90%时，常规消化和离心细胞，用2 mL细胞冻存液重悬。将细胞悬液分装到两个2 mL的冻存管中，置于冻存盒中后在-80 ℃冰箱中过夜，置于液氮中冷冻保存。

复苏：从液氮罐中取出冻存管，迅速37 ℃水浴，轻轻晃动至细胞溶液完全融化。离心重悬浮后移入T-25培养瓶中继续培养。

1.4 冷冻前后细胞存活率

冷冻前后的细胞用0.4%的台盼蓝染液进行染色，稀释后滴到血球计数板，加盖玻片，进行细胞计数。显微镜下活细胞不能被着色，而死细胞被染成蓝色。

1.5 生长曲线

G2代耳成纤维细胞经消化制成细胞悬液，使其终浓度为1×104个mL，接种到24孔培养板中进行培养。使用血球计数板从第2天开始计数，连续计数8 d，每天计数3个孔，取平均值。细胞培养过程中每3 d换液1次。计数结果制成的折线图即为细胞的生长曲线。

1.6 微生物检测

检测细菌、真菌时，将细胞等量接种于胰蛋白胨和麦芽汁培养基中，并设阴性和阳性对照[4-5]。

从装饰花纹上看，无论是工笔还是写意其表现出的题材都具有吉祥道喜之意。在这些纹样中一般表现的题材有花卉纹、山石、海水纹、鱼藻纹、回纹、卷线纹、龙、凤、麒麟纹、松、竹、梅纹、人物纹等。这些纹路一一反应出当时的社会文化。

支原体污染检测使用支原体染色试剂盒(碧云天)。检测之前，细胞用不含双抗的培养液传代培养2—3次。

1.7 染色体分析

选择处于对数生长期的细胞制备染色体标本，按照常规试验方法制备染色体[6]。待染色体标本在空气中完全干燥后，用Giemsa溶液室温下染8 min左右，流水冲洗掉多余的染液，室温下干燥。片子干燥后，在显微镜下观察，并统计拍照。

1.8 同工酶酶谱分析

取生长旺盛的细胞，常规消化和收集细胞，PBS洗3次后加细胞裂解液提取细胞蛋白，分装置于-80℃冰箱保存。制备7.5%分离胶和3%浓缩胶以及电泳缓冲液，加样，电泳条件为160 V、3 h。电泳结束后，把分离胶放到染色槽里进行乳酸脱氢同工酶和苹果酸脱氢同工酶染色，37 ℃水浴锅中染色40 min。染色结束后，回收染色液，加入脱色液进行脱色，过夜，拍照[7]。

1.9 脂质体介导转染和单克隆培养

采用Lipofectamine LTX and PLUSTM试剂盒进行细胞转染，质粒采用含NEO抗性基因的EGFP质粒，主要步骤如下：取100 μL OPTI-MEM，分别加入1 μg质粒DNA，1 μL PLUS，混匀后静置5 min，加入2.5 μL LTX，混匀后室温放置30 min。将获得的转染液轻轻加入含400 μL 的OPTI-MEM细胞培养液中，轻轻漩涡混匀，转染6 h后更换培养液，24 h后观察细胞的转染率。单克隆筛选时，先使用400 μgmL的G418连续培养7 d，再使用200 μgmL G418进行维持，直到单克隆出现为止。

2 结果与分析

2.1 梅山猪成纤维细胞体外培养形态学观察

经5—14 d的培养，可见耳缘组织块周围有细胞爬出，细胞呈典型的成纤维形、长梭形、三角形等。成纤维细胞和上皮细胞贴壁时间及对胰蛋白酶敏感程度不同，原代细胞中有少量的上皮细胞用胰蛋白酶消化的方法进行传代，使成纤维细胞纯化，传代后的细胞呈放射状或旋涡状生长(图1)。

2.2 梅山猪成纤维细胞冷冻前后细胞存活率

随机选取5个细胞系进行数据统计，培养的梅山猪耳成纤维细胞冷冻前后的平均细胞存活率分别为95.21%、90.08%。图2为细胞冷冻前后台盼蓝染色图片，死亡细胞染色后呈蓝色。

2.3 梅山猪成纤维细胞生长的动态观察

2.4 微生物检测

细菌和真菌检测后，接种细胞的液体培养基未出现混浊及其他变化，培养基清亮透明，表明未有细菌和真菌污染，阳性对照的培养基中则出现明显的混浊或沉淀。

支原体试剂盒检测后，所有成纤维细胞表面光滑，细胞核呈椭圆形，发出蓝色荧光，未观察到细胞周围微粒状或丝状蓝色荧光，显示细胞均无支原体污染(图4)。

2.5 梅山猪耳成纤维细胞染色体观察

随机挑选5个处于对数增长期的梅山猪耳成纤维细胞系进行染色体计数(图5)，染色体数目为38条的比例为92.31%，说明所建立的细胞系是稳定的二倍体，符合建系要求。

2.6 同工酶分析

如图6所示，乳酸脱氢同工酶酶谱中有 5 条带，从阴极到阳极依次为 LDH1、LDH2、LDH3、LDH4 和 LDH5，相对迁移率分别为1.85%、5.56%、16.67%、25.00%和 32.40%；苹果酸脱氢同工酶酶谱中有2条区带，依次为m-MDH 和s-MDH，相对迁移率分别为28.15%和36.11%。

2.7 脂质体转染

经脂质体转染，5个细胞系均能产生绿色荧光，EGFP阳性率为45.23%—67.32%。经G418筛选后，各个细胞系均能有效形成单克隆集落。部分结果如图7所示。

3 结论与讨论

常用的原代细胞培养方法主要有组织块贴壁法和酶消化法，陆会宁等[8]比较了不同的原代细胞培养方法，结果表明组织块贴壁法效果最好。周向梅等[6]采用贴壁培养原代细胞，1—2 d可见组织块周围有细胞爬出，郝柱等[9]研究表明细胞是在2—3 d长满培养瓶，而本研究中最早5 d可见组织块周围有细胞生长，可能是因为组织来源不同所致。另外，本研究中传代细胞生长速度比原代细胞快，第2天即进入指数对数生长期，得到的成纤维细胞冷冻前后均有较高的存活率，表明液氮冷冻保存对细胞损伤较小[10-11]。

细胞建系时染色体分析尤为关键，本研究中92.31%的猪耳成纤维细胞染色体数目为38条，与正常猪的染色体数目相同[12-13]，符合细胞建系要求。

不同的动物品种，同工酶是存在差异的[14-15]。常用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对同工酶进行分析，检测细胞是否存在种间污染[16]。大多数哺乳动物乳酸脱氢同工酶酶谱(Lactate dehydrogenase，LDH)有5条区带，分别是LDH1、LDH2、LDH3、LDH4 和 LDH5，苹果酸脱氢同工酶酶谱(Malate dehydrogenase，MDH)有m-MDH 和s-MDH 2条区带，前者迁移率比后者小。本研究中梅山猪耳成纤维细胞系LDH五条带的相对迁移率分别为1.85%、5.56%、16.67%、25.00%和 32.40%，m-MDH和s-MDH的相对迁移率分别为28.15%和36.11%，与郝柱等[9]在金华猪耳成纤维细胞上的LDH 酶谱(迁移率15.23%、29.55%、44.84%、58.45%和93.40%)和MDH 酶谱(迁移率48.39%和67.74%)，以及关伟军[17]等在五指山小型猪耳纤维细胞上的LDH酶谱(迁移率18.75%、28.75%、41.25%、51.25%和 60.00%)及MDH 酶谱(迁移率48.39%和67.74%)有较大差异，表明本研究所培养的梅山猪耳成纤维细胞纯度更高。

本研究中细胞经EGFP脂质体转染后，大部分细胞发出荧光，表明所建立的细胞系适合于脂质体转染。此外，本研究所抽取的5个细胞系经G418筛选后均能有效形成单克隆集落，表明细胞生长旺盛，对筛选药物较为敏感，这些细胞系可为后续的转基因克隆等研究提供素材[18-19]。

梅山猪是国内地方猪种的优良品种，为保护该品种种质资源，本研究从细胞水平对梅山猪耳纤维细胞进行建系，所建细胞系生长快、生物稳定性好，为以后对梅山猪的深入研究提供生物材料，并可为其他动物建系提供参考依据。