猪圆环病毒3型PCR诊断方法的建立及初步应用

姜玲玲，徐 雨，余国富，魏赐开，唐远江，卢昱希，蒲 龄，杨 莉，余 波*

(1.贵州省农业科学院 畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005; 2.贵州省关岭县畜牧服务中心，贵州 关岭 561000; 3.贵州省清镇市动物疫病预防控制中心，贵州 清镇 551400; 4.贵州省瓮安县农业农村局，贵州 瓮安 550400)

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科、圆环病毒属，为单股负链环状DNA病毒，是兽医学上迄今发现的最小的病毒。根据PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列将PCV分为PCV1和PCV2两种血清型，其中PCV1不具有致病性，而PCV2能引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪增生性坏死性肺炎及其他猪圆环病毒相关疾病[2-3]。2016年10月PALINSKI等首次从有类似剧烈猪皮炎肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)症状的死亡母猪身上利用宏基因组测序技术鉴定出一种新的圆环病毒即猪圆环病毒3型(PCV3)以来，1年多的时间里PCV3已经在亚洲、欧洲、美洲的许多国家和地区被检测到。KU等对中国11省1直辖市和地区35个农场的222份样品进行PCV3的PCR检测，阳性农场占比68.6%，表明PCV3已经在中国广泛流行。FU等对中国2015-2017年收集的中国南方部分省份临床样品进行的检测结果显示，养殖场阳性率从 41.2%上升到60.5%，样品阳性率从21.9%上升到26.7%，而且存在混合感染情况，PCV3阳性样品与PCV2的共感染率达22.3%，增加了该病的防控难度。邢广源采用常规PCR检测方法对不同日龄、不同组织器官进行检测，结果显示PCV3检出率最好的组织器官为淋巴结，其次为肺、扁桃体、肾、脑等组织，表明PCV3对动物的危害范围广。徐国等首次证实贵州省存在PCV3。2018-2019年对贵州各屠宰场进行PCV3核酸检测，2018年阳性率为14.2%，2019年阳性率为11.6%，表明贵州屠宰场PCV3感染率较高。

PCV3基因组包含2000 bp，具有与PCV1和PCV2相似的基因组结构[9-11]，PCV3病毒可能与PCV相关性疾病相关，在临床上表现为仔猪断奶后出现多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)和猪呼吸道疾病综合征(PRDC)。目前尚未见报道分离到PCV3活毒株，对其理化性质了解较少。PALINSKI R在猪睾丸细胞和猪肾细胞(PK-15)进行细胞分离，未观察到细胞病变，间接免疫荧光检测也无明显荧光。现对PCV3检测的主要方法包括宏基因组、常规PCR、多重定量实时聚合酶链反应(mq PCR)、Taq Man实时PCR、实时重组酶聚合酶扩增(rt-RPA)、间接ELISA等，其中，常规PCR在实验室快速诊断中的应用越来越普遍[12-13]，然而PCV3在屠宰场的流行情况报道较少。因此，笔者等进行了PCV3的PCR诊断方法研究，为PCV3在屠宰环节的分子流行病学调查研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 毒株 猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)和猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)DNA模板由贵州省畜牧兽医研究所保存。

1.1.2 病料组织 采自 2018-2019年贵州省瓮安县、镇远县、晴隆县、关岭县、贵阳市乌当区和清镇市等7个屠宰场，共采集样品376份，包括猪淋巴结和肺脏。

1.1.3 主要试剂 DNA提取试剂盒(厦门百维信生物科技有限公司)，2×TaqMaster Mix和Goldview(天根生化科技有限公司)，DL 2000Marker、DL 1000 Marker(大连宝生物工程有限公司产品)。

1.2 PCR检测方法的建立

1.2.1 引物设计与合成 参照文献中的引物和Gen Bank中已公布的参考序列设计 1对引物，引物序列为:PCV3-F:5′-TTACTTAGAGAACGGACTTG

TAACG-3 ′，PCV3-R:5′-AAATGAGACACAGAGCTAT

ATTCAG-3′，目的片段为649 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 DNA模板提取 取病料组织约0.1 g，加入600 μL灭菌生理盐水置于2 mLEP管后，采用上海净信组织研磨仪研磨1 min后，将EP管于4 000 r/min离心3 min。用移液器吸取上层研磨液200 μL，加入蛋白酶K 5 μL，10%SDS溶液20 μL，摇匀置于55℃水浴锅2 h后，用移液器吸取上层溶液200 μL置于DNA提取试剂盒第一孔，加入30 μL DTT溶液(1 mol/L)，用Lab-Aid820核酸提取仪进行自动提取[14]。

1.2.3 PCV3阳性模板的制备 以1.2.2提取的样品DNA为模板，用引物PCV3 F和PCV3R进行PCR反应，将大小为649 bp的目的片段切胶回收，送上海生工生物工程有限公司测序鉴定。

1.2.4 PCR反应条件优化 对退火温度(50℃、55℃、60℃、65℃)、延伸时间(60 s、65 s、70 s、75 s)、引物量(0.5 μL、1 μL)、模板量(1 μL、2 μL、3 μL)等4个变量对PCR检测方法进行优化，获得最佳反应条件。

1.2.5 PCR特异性检测 用1.2.3建立的PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)，并以阳性质粒和超纯水依次作为阳性和阴性对照，检测该PCR方法的特异性。

1.2.6 PCR敏感性试验 采用Nanophotometer核酸仪测定阳性模板的浓度，进行敏感性试验，将模板进行倍比稀释后，分别取2 μL作模板进行扩增。

1.3 临床样品PCR检测

将2018-2019年采集的猪肺组织、淋巴结等376份病料组织按1.2.3建立的PCR方法进行PCV3检测。

2 结果与分析

2.1 阳性模板

用引物PCV3 F和PCV3 R对样品进行扩增，得到与预期相符的649 bp的目的条带(图1)。测序结果与NCBI公布的PCV3/CN/Jiangxi-62-2016毒株的同源性达99.54%，表明该DNA可作为阳性模板。

注：1为阴性对照，2为阳性模板，M为Marker DL2 000。
Note: 1，negative control; 2，positive template; M，Marker DL2 000.
图1PCV3的 PCR扩增结果
Fig.1 PCR amplification of PCV3

2.2 PCR反应条件的优化

经条件优化，确定PCR最佳反应为2×Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，2 μL模板，dd H2O 8.5 μL。PCR反应条件为94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，72℃延伸5 min。扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

2.3 PCR优化方法的特异性

利用建立的最优PCR反应条件，对PRRSV、PRV、PPV进行扩增。结果(图2)表明，建立的PCR方法只能扩增出PCV3样品中的特异性目的片段，而对PRRSV、PRV、PPV均扩增不出目的片段，建立的PCR方法特异性较好。

注：1为PRRSV病毒，2为PRV病毒，3为PPV病毒，4为阴性对照，5为PCV3阳性对照，M为Marker DL2 000。
Note：1，PRRSV virus; 2，PRV virus; 3，PPV virus; 4，negative control; 5，PCV3 positive control; M，Marker DL2 000.
图2PCR特异性检测结果
Fig.2 PCR specific detection results

2.4 PCR优化方法的敏感性

测得阳性模板浓度为143.5 ng/μL，则不同稀释度模板浓度依次为1.43×105pg/μL、1.43×104pg/μL、1.43×103pg/μL、1.43×102pg/μL、1.43×10 pg/μL、1.43 pg/μL。用建立的最优化PCR反应条件，对不同稀释度的模板进行PCR扩增，结果(图3)表明，建立的不同模板浓度PCR扩增条带随模板浓度降低而逐渐减弱。

注：M为 Marker DL1000，1～6浓度依次为1.43×105pg/μL、1.43×104pg/μL、1.43×103pg/μL、1.43×102pg/μL、1.43×10 pg/μL、1.43 pg/μL；7为阴性对照。
Note：M，Marker DL1000; 1～6 means 1.43×105pg/μL，1.43×104pg/μL，1.43×103pg/μL，1.43×102pg/μL，1.43×10 pg/μL and 1.43 pg/μL respectivey. 7，negative control.
图3PCR敏感性检测结果
Fig.3 PCR sensitivity detection results

2.5 PCR优化方法的临床样品检测

用建立的最优化PCR反应条件对2018-2019年贵州各屠宰场376份组织的检测结果(表1)显示，其检测出阳性样品46份，2018年和2019年的阳性率分别为14.2%和11.6%。

表1 2018-2019年试验样品 PCV3检测结果Table 1 Detection results of tested PCV3 samples in 2018 and 2019

3 结论与讨论

根据猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3，PCV3)特异性序列设计引物，通过敏感性试验、特异性试验、重复性试验及测序验证后，建立的PCR方法确定PCR最佳反应为2×Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，2 μL模板，dd H2O 8.5 μL。PCR反应条件为94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，72℃ 延伸5 min。特异性扩增出649 bp的目标片段，具有较好的敏感性，可扩增的最低模板浓度为0.143 ng/μL；用建立的PCR方法对屠宰场送检的376份组织样品的检测显示，PCV3平均阳性率为12.9%，建立的PCR诊断方法较好。

目前，PCV3感染尚未列入世界动物卫生组织(OIE)通报性疫病名录及《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》，该病毒随生猪及其产品国际贸易传播风险尚待评估[15]，且该病目前没有疫苗，如毒力或致病力发生变化，屠宰场将是一个重要传播源。试验建立了PCR诊断方法，对贵州多个屠宰场进行检测，将为PCV3在屠宰环节的分子流行病学调查研究奠定基础。