抗白粉病基因RPW8的抗性作用研究进展

罗昌国，王三红，袁启凤，郑 伟，宋 莎

(1.贵州省农业科学院 果树科学研究所，贵州 贵阳 550006； 2.南京农业大学 园艺学院，江苏 南京 210095)

1997年在拟南芥(Arabidopsisthaliana)上发现3个抗白粉病﹝Erysiphespp.(Golovinomycesspp.)﹞的位点RPW(RESISTANCE TO POWDERY MILDEW)6/7/8，其中RPW8.1(GenBank ID：AF273059)和RPW8.2(AF273059)基因是拟南芥Ms-0生态型2个紧密连锁的白粉病抗性基因，于2001被成功克隆，并具有抗白粉病的功能。RPW8在不同生态型的拟南芥中存在被同源基因取代的现象，即便基因不被取代也可能在功能方面存在一定差异。在来自全球各地的不同生态型的拟南芥中，RPW8.1和RPW8.2基因主要存在于抗白粉病拟南芥Ms-0、Kas-1、Wa-1、Ei-5、Nw-0等5个生态型中；在感病拟南芥Col-0、Fr-3、Is-1、Nie-0、Sg-2等生态型中则缺乏RPW8.1和RPW8.2基因，取而代之的是HR4；而Bu-06、Is-0、K1-0生态型中具备RPW8.1和RPW8.2基因，但却表现出感病的性状。在拟南芥中，RPW8的同源基因还有HR1(Tair ID：At3g50450)、HR2(At3g50460)和HR3(At3g50470)。RPW8基因在不同种类植物中，甚至同种不同生态型中，其基因序列和功能都存在差异。笔者等主要对具有抗性功能的RPW8或其同源基因的研究成果进行综述，并对RPW8基因在种群关系、抗病育种上的应用价值进行展望，以期为白粉病抗性调控、抗性育种等方面的研究提供参考。

1 RPW8基因的生理生化特征

1.1 RPW8基因的结构与序列特征

在拟南芥(Col-0生态型)基因组数据库中(https：//www.arabidopsis.org)，HR4位于第3条染色体上。RPW8基因在亲缘关系较近的不同生态型或近缘种中，基因位点相对固定，但可能由于重复片段插入、缺失、交换等事件发生，使得PRW8被同源基因取代或丢失，并在序列和功能方面存在较大差异。从图1看出，Ms-0生态型拟南芥RPW8.1和RPW8.2基因位于HR3和SPK-2(SNF1-RELATED PROTEIN KINASE)之间，Col-0生态型的HR4也位于HR3和SPK-2之间。琴叶拟南芥(Arabidopsislyrata)则只有RPW8.2基因，位置在HR3和SPK-2之间。

注：At为拟南芥；Al为琴叶拟南芥。
Note: At，A.thaliana; Al，A.lyrata.
图1拟南芥及其近缘种中RPW8基因的位点
Fig.1RPW8 locus ofA.thalianaandA.lyrata

RPW8基因在不同植物中的数量、基因长度、基因结构等方面存在较大差异(图2)。在43个不同的生态型拟南芥的基因序列比对中，RPW8.1基因长度为718个核苷酸，包含长度分别为281 bp和229 bp的2个外显子和1个208 bp内含子，编码148个氨基酸；RPW8.2基因长度为653个核苷酸，包含长度分别为296 bp和229 bp的2个外显子和1个183 bp内含子；编码174个氨基酸。拟南芥RPW8.1(核苷酸多样性π=0.012)和RPW8.2(π=0.010)系列比同源基因HR3(π=0.002)和HR4(π=0.002)的变化大。琴叶拟南芥和拟南芥上RPW8.2同源基因的核苷酸和蛋白序列相似度只有81%和61%。油菜(Brassicanapus)的4个BnHRs也只有2个外显子和1个内含子，外显子和内含子核苷酸多样性在0.001～0.015。华东葡萄(Vitispseudoreticulata)中克隆到的5个RPW8基因(GenBank ID：KU365990、KU365991、KU365992、KX389173和KX389175)，编码的蛋白长度在647～825个氨基酸，相似度为78%，每个基因包括5个外显子和4个内含子。

注：At为拟南芥；Bn为油菜；Vp为华东葡萄。
Note:At,A.thaliana；Bn,B.napus；VP,V.pseudoreticulata.
图2RPW8基因的结构
Fig.2 Structure ofRPW8 genes

1.2 RPW8氨基酸序列的重要位点

位于RPW8.2蛋白第64位、第116位和第161位的苏氨酸(Thr-64)、天冬氨酸(Asp-116)和苏氨酸(Thr-161)对白粉病的抗性至关重要，尤其位于卷曲结构域的Thr-64是蛋白磷酸化的关键位点，在过敏性抗病反应中起决定性作用。N端1～22位氨基酸为跨膜结构域TMD(Trans-membrane domain)，TMD的5～14位序列(VAAGGALGLA)在蛋白稳定和锚定白粉菌吸器外膜EHM(Extrahaustorial membrane)中起比较关键的作用。C端的111位亮氨酸也是锚定EHM的关健位点，缺少此位点及之后的序列也对蛋白锚定有影响。RPW8.2N端30个氨基酸对其与14-3-3λ(G-BOX FACTOR 14 LAMBDA或称14-3-3 lambda)蛋白互作没有影响，而C端的38个氨基酸则影响很大。通过酵母双杂试验发现，RPW8.2蛋白能与14-3-3 λ(At5g10450)蛋白互作，RPW8.1蛋白与14-3-3λ互作的能力很弱。

1.3 RPW8基因与R基因的关系

多数R抗病基因(Resistance Genes)编码的蛋白通常具有1个核苷酸结合位点(Nucleotide-binding site ，NBS)和1个羧基端的亮氨酸重复系列(Leucine-rich repeats，LRRs)，因此亦将此类基因称为NBS-LRR基因(文中用该名称)或NBS基因。根据此特征可将NBS-LRR类R蛋白分为两大类：一类是氨基含有1个TIR(Toll/interleukin receptor)域的TIR-NBS-LRR蛋白，或又称TIR-NBS-LRR，简写为TNLs蛋白；另一类是无TIR结构域的none TIR-NBS-LRR蛋白，简称nTNLs蛋白。在nTNLs中，又将氨基端含有卷曲螺旋结合位点(Coiled-coiled motif)的蛋白归类为CC-NBS-LRR蛋白，简写为CNLs蛋白[9-10]。亦有学者将此类R基因编码的蛋白称为NB-LRR蛋白(Nucleotide binding-leucine rich repeat)[11-13]。 NBS结构域通常包括P-loop(GxGKT)、Kinase2(LxxLDDV)、Kinase3或称RNBS-B (GxxxxxT(T/S)R)、GLPL(GLPL)等保守结构，LRR结构域序列通常为xxLxLxx结构[14]。RPW8属于nTNLs，N端含1个跨膜结构域TMD(N-terminal transmembrane domain)和1～2个卷曲螺旋结构域(Coiled-coil)，还具有R基因常有NBS和LRR结构域[15-17]，因此，有学者将RPW8归为一类特殊类型R基因，即RPW8-NBS-LRR，简写为RNL，或者将其归在X-NBS-LRR类型中[17-20]。

1.4 RPW8基因的起源与进化

在藻类植物中，灰色藻门(Glaucophyta) 和红藻门(Rhodophyta)还没有出现TNLs和CNLs基因，绿藻门(Chlorophyta)和轮藻门(Charophyta)才开始有NBS-LRR基因的出现；苔藓植物如地钱(Marchantiapolymorpha) 、泥炭藓(Sphagnumfallax)和开花植物中，NBS-LRR基因较丰富，但是单子植物中没有TNLs类型基因[21]。RPW8虽属于NBS-LRR基因，但在藻类植物中没有出现，直到苔藓植物(Bryophyta)才出现。其他的开花植物则存在数量不等的RPW8基因[22]。在草莓、苹果、梨、桃和梅基因组中，预测的RPW8基因分别有24个、20个、22个、11个和13个[23]。截型苜蓿(Medicagotruncatula)、木豆(Cajanuscajan)、菜豆(Phaseolusvulgaris)和大豆(Glycinemax)中，RPW8基因分别有8个、4个、5个和9个。RPW8与ADR1(activated disease resistance gene)和NRG1(N-required gene 1)有较高的同源性，在基因的进化和形成过程中可能存在比较紧密的关系。RPW8基因可能从ADR1或NRG1进化而来，蕨类植物(Pteridophyta)，如石松门(Lycopodiophyta)以及单子叶植物中在进化过程中只保留ADR1和NRG1类似基因或数量极少的RPW8同源基因[24-25]。

2 RPW8基因的抗病功能

2.1 基因表达特点

培养基接种木霉菌(Trichodermaatroviride)试验中，Col-0生态型拟南芥的HR4在接种后96 h，表达比对照提高4倍； Ms-0生态型拟南芥的RPW8.1在接种后96 h，表达比对照提高155倍，RPW8.2则不明显[26]。通过PRW8.1-YFP(yellow fluorescent protein)和PRW8.2-YFP融合基因在洋葱表皮细胞和拟南芥叶片表皮细胞表达后，两者的亚细胞定位主要在膜系统上，包括细胞质膜、内质网和高尔基体。亚细胞定位过程中观察到RPW8在细胞中有流动现象，这一现象在进一步研究后被证实是RPW8蛋白利用胞内小泡运输(Vesicle trafficking)并通过微丝细胞骨架(Actin cytoskeleton)在细胞内转运。通过转基因植物中稳定表达PRW8.1-YFP和PRW8.2-YFP发现，PRW8.1主要在叶肉细胞中表达，很少在表皮细胞中表达，PRW8.2则在叶肉细胞和表皮细胞中均有表达[27]。

2.2 抗病作用

目前，RPW8抗病方面的研究以白粉病居多。将Ms-0的RPW8.1和RPW8.2基因中任何1个或2个同时转化到Col-0中，转基因植株都表现出提高白粉病抗性。异位表达(Ectopic expression)拟南芥RPW8.1基因，使得PTI﹝PAMP(Pathogen-associated molecular pattern )-triggered immunity﹞通路诱导的抗性相关的基因PRRs(Pattern recognition receptors)、FLS2(Flagellin Sensing2)、CERK1(Chitin elicitor receptor kinase1 )、BAK1(BRI1-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE1)、BIK1(BOTRYTIS-INDUCED KINASE1)、PBL1﹝AvrPphB susceptible1 (PBS1)-like﹞、MPK3、MPK6和PBL2上调表达，以及PR1(Pathogenesis-related)、PR2和WRKY29上调表达，同时诱导H2O2产生，出现HR(Hypersensitive response)过敏性反应类似的细胞坏死症状。转PRW8基因的烟草可提高白粉病的抗性，其对抗性调控依赖于SA(Salic acid)通路和EDS1(ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY1)通路，并伴随着类似的HR反应；但同样转PRW8基因在蕃茄(Lycopersicon esculentum)上未表现出抗白粉病(Oidiumlycopersici)[28]。过量表达HR1、HR2和HR3基因也有提高白粉病抗性的作用，HR4则更易感白粉病；HR1、HR2和HR3敲除后，HR2和HR3敲除株系更易感白粉病[29]。感白粉病生态型和抗白粉病生态型的抗病杂交后代只对白粉菌分生孢子有抑制作用，而在病原菌其他的生活周期抗性不明显[30]。当环境发生变化时，不同白粉病抗性的拟南芥植株也会发生一定变化[31]。RPW8对白粉病的抗性可能同时受到基因本身、遗传背景和环境的影响。RPW8除了具有抗白粉病的功能外，可能还具有其他抗性作用，水稻中异源表达拟南芥RPW8.1基因表现出抗稻瘟病(Pyriculariaoryzae)和白叶枯病(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)[32]。华东葡萄(Vitispseudoreticulata)VpRPW8基因受霜霉病诱导表达，转VpRPW8基因烟草(Nicotianabenthamiana)表现出抗疫霉病(Phytophthoracapsici)。转PRW8基因拟南芥对霜霉病(Hyaloperonosporaparasitica)和花叶病毒(Cauliflowermosaicvirus)的抗性有提高作用；对假单胞菌(Pseudomonassyringaepv.maculicolaES4326)的抗性没有影响，而更感链格孢菌(Alternariaspp.)和 灰霉菌(Botrytisspp.)[27]。

2.3 RPW8调控机制

SA、EDS1和NPR1都是植物抗病过程中的重要信号通路[33-37]。RPW8.1和RPW8.2对白粉病的抗性常需要SA和EDS1、PAD4、EDS5、NPR1的参与，并伴随HR出现[15]。1998年筛选到edr1(Enhanced disease resistance 1)抗白粉病突变体，其没有提高PR1和PR5的表达[38]。EDR1通过抑制RPW8.1和RPW8.2的转录，进而抑制HR细胞死亡和白粉病抗性[15]。EDR1负调控RPW8的抗性亦需要EDS1和SA的参与[15]，EDR1也联系SA与ET(ethylene)[39]、ABA(abscisic acid)[40]信号通路之间的桥梁。EDR2突变体能增强白粉病的抗性，突变体中RPN1a蛋白起关键作用，RPN1a是蛋白降解系统中26S蛋白的一个亚基，也是edr1和pmr4白粉病性抗性调控所必需的，RPN1a基因突变使植株更易感白粉病[41]。XCT(X-CHROMOSOME ASSOCIATED PROTEIN5(XAP5) CIRCADIAN TIMEKEEPER)基因(At2g21150)正调控RPW8.1的抗性[42]，而XCT是ET信号通路中重要的调控因子[43]。14-3-3λ(GF14 lambda)正调控RPW8的抗性，14-3-3λ是真核生物普遍存在的调节蛋白，通过识别特异的磷酸化序列与靶蛋白互作，也是蛋白间相互作用的重要桥梁蛋白。14-3-3λ蛋白能够与APX3 (Ascorbate peroxidase) 和AKR2互作，并可能参与植物氧化代谢过程。14-3-3λ还与BZR1转录因子互作，参与油菜素内脂信号通路BRs(Brassinosteroid signaling)。在酵母和植物体还能观察到RPW8.2蛋白能与PAPP2C(Phytochrome-associated protein phosphatase type 2C，At1g22280)互作，RNAi干涉PAPP2C后，出现RPW8过表达的表现，即叶片出现敏性细胞死亡并提高白粉病抗性[44]。PP2C是通过调控CDK(Cyclin-dependent protein kinases)去磷酸化来调节细胞周期和细胞凋亡，PP2C还可通过去磷酸化作用调控MAPK(Mitogen-activated protein kinase)信号通路，进而可能关联病菌入侵寄主时细胞壁完整性过程[45-46]。与PRW8介导密切相关的基因ERH(Enhancing RPW8-mediated HR-like cell death)突变体erh表现为SA的积累和RPW8表达量的上升，ERH与酵母IPCS(Inositolphosphorylceramide synthase)同源，并编码植物IPCS。IPCS是调控细胞PCD(Programmed cell death)的重要基因，在植物防疫反应中扮演着重要角色[47]。

白粉菌在入侵过程中形成吸器体(Haustorium)、吸器外质膜(Extrahaustorial membrane，EHM)和吸器外间质(Extrahaustorial matrix，EHMx)[48]，将白粉菌吸器从叶片组织中分离出来，可观测到PRW8.2蛋白汇集到吸器外质膜上[49]，PRW8同源蛋白也有类似现象[29]。RPW8.2被白粉菌诱导表达后还激发过氧化氢在吸器复合体(Encasement of Haustorial Complex，EHC)内高浓度富集，同时激发富含胼胝质(Callose)的吸器复合体形成，并将高浓度的过氧化氢限制在吸器复合体内，从而达到抗病的效果而不伤害寄主细胞；在植株抗白粉病过程中，胼胝质沉积现象在其他抗病基因型中也起到十分关键的作用[50-51]。胼胝质沉积往往也需要SA的诱导和参与[52]。当EHC不足以阻止白粉菌的入侵时，RPW8.2表达量便不断增加直至受侵染细胞死亡，从而消灭入侵的白粉菌[53]。RPW8.2-YFP不但可以锚定在白粉菌吸器外质膜上，也可以锚定霜霉菌吸器表面。但是，失去抗性功能的RPW8突变体即便可以锚定到吸器外质膜上，或者失去锚定功能的RPW8突变体均不能产生抗病性[54]。

RPW8的上调表达常伴随着活性氧产生，过量的活性氧产生不仅对病原菌具有杀伤作用，同时也对寄主本身形成伤害，除EHC对寄主细胞保护外，黄嘌呤脱氢酶XDH1(XANTHINE DEHYDROGENASE1)对寄主保护也有重要作用。XDH1通过调控ROS过程，影响RPW8介导的白粉病抗性，黄嘌呤脱氢酶是植物几种钼酶之一，XDH即可在嘌呤代谢过程中催化黄嘌呤(xanthine)和次黄嘌呤(of xanthine)生成尿酸，还可转化为黄嘌呤氧化酶还原酶(Xanthine oxidoreductase，XOR)促进ROS的产生。在白粉病侵染过程中，一方面XDH促进ROS破坏吸器的形成，另一方面作为看家酶类存在，代谢产生尿酸来保护寄主细胞免受活性氧的伤害。XDH1基因启动子包括3个WRKY结合元件W-box(TTGACC/T)，预示其可能受WRKY的调控[55-56]。

3 展望

白粉病是最为常见的一种植物病害，白粉菌种类有600余种，每个种又存在或多或少的生理小种，其为害的植物寄主近万种。在进化过程中，很多白粉菌(或生理小种)与相应的植物种类(或生态型)形成专一性的寄生关系，RPW8在这一进化过程中也发生了复杂遗传变异的事件，这些事件是否与白粉病直接相关还有待深入研究。白粉病抗性调控基因除RPW8外，目前已报道在植物白粉病抗性调控中起重要作用的还有WRKY、PMR(powdery mildew resistant)、MLO(mildew locus O)和MLA(mildew locus A)等基因。RPW8在不同植物或生态型中的基因数量、结构、功能等方面有着丰富的变化，为白粉病抗性研究带来了一定的难度，同时也带来了机遇：当RPW8发挥抗病作用并占主导地位时，如何通过调控网络与其他抗病基因协同调控；当RPW8失去抗病功能时，其在生命体中又扮演怎样的角色，其他抗病基因如何弥补RPW8的抗病功能，使植株产生抗病性，这些都值得去探索。RPW8基因在同一类群内丰富的核苷酸多样性和不同类群间高频次的基因片段的插入、交换、缺失等事件的发生，使其成为种群关系甚至不同植物种类进化关系的研究提供了一个较好的切入点。随着对RPW8基因研究的不断深入，预期其可为不同种类植物白粉病的抗性机制、白粉病抗性育种等方面的研究和应用提供重要的参考价值。