绿萝叶腐病病原菌16S rDNA序列的克隆与分析

邬张颖，徐凡舒，钟依妮，马佳莹，朱 欣，张慧娟，蒋 明

(台州学院 生命科学学院，浙江 椒江 318000)

绿萝(Epipremnumaureum)是天南星科(Araceae)常绿藤本植物，株型美观、叶色、叶型多样，且易繁殖，是一种深受人们喜爱的室内观赏植物。绿萝以叶色碧绿的种类最为常见，此外还有丰富的变异类型，有叶片卷曲绿中带白的“N’Joy”绿萝(E.aureum’N’Joy’)、叶片呈浅黄色的“金藤”绿萝(E.aureum’All Gold’)及叶片具白色斑块的“玛伯皇后”绿萝(E.aureum’ Marble Queen’)等。绿萝除有较高的观赏价值外，还能吸收有害气体和净化水体，在环境保护中起着重要作用。与其他植物类似，绿萝在栽培过程中易受多种病害的侵扰，常见的病害有褐斑病、炭疽病、根腐病、叶斑病和叶腐病等，由真菌或细菌引起，发病时叶片、茎或根部受害，导致植株生长速度减慢和观赏价值下降，严重时甚至整株死亡[4-5]。叶腐病(Leaf rot)是一种能引起叶片、叶柄腐烂的病害，在高温高湿环境下易发生，严重时整个受害组织呈褐色并坏死，影响绿萝的观赏价值。目前，有关绿萝叶腐病相关的研究鲜见报道。

果胶杆菌属(Pectobacterium)细菌隶属于溶果胶菌科(Pectobacteriaceae)，该科由果胶杆菌属、布伦纳氏菌属(Brenneria)、菊欧文氏菌属(Dickeya)和索达里氏菌属(Sodalis)等属组成，大部分种类为植物的病原菌。果胶杆菌属是一类腐生细菌，是多种作物和观赏植物的致病菌，可引起软腐病、黑胫病和茎基腐病等病害，每年造成的经济损失巨大。常见的果胶杆菌属病原细菌有胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种(P.carotovorumsubsp.brasilliensis)、山葵果胶杆菌(P.wasabiae)、胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(P.carotovorumsubsp.carotovorum)和黑腐果胶杆菌(P.atrosepticum)等[7-9]。台州学院生命科学学院分子生物学实验室于前期从绿萝叶片中分离到叶腐病的病原菌菌株LR12，经形态学、生理生化和离体接种鉴定后，初步判断为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种，研究以其为材料，在克隆16S rDNA的基础上，进行序列分析和系统发育分析，以期为后续开展该病原细菌的分子鉴定和应用研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种菌株LR12，分离自绿萝叶腐病病叶，经鉴定后保藏于台州学院生命科学学院分子生物学实验室。该菌为革兰氏阴性菌，菌体短杆状，具鞭毛；菌落表面光滑、圆形，呈乳白色。

DNA提取试剂盒和PCR产物回收试剂盒均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司(鼎国生物)。

序列比较所用16S序列下载自NCBI(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov)，分别是P.polaris(NR_159084)、P.carotovorumsubsp.odoriferum(JF926728)、胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种(JF926720)、鼻硬肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniaesubsp.rhinoscleromatis)(NR_114507)、产气克雷伯氏菌(K.aerogenes)(MN326677)、 菊欧文氏杆菌香蕉致病变种(D.paradisiaca)(AF520710)、水稻基腐病菌(D.zeae)(NR_041923)、花叶万年青狄克氏菌(D.dieffenbachiae)(AF520712)、花叶万年青狄克氏菌亚种(D.dadantiisubsp.dieffenbachiae)(NR_041924)、水生沙雷氏菌(Serratiaaquatilis)(NR_147771)、S.glossinae(FJ790328)、居泉沙雷氏菌(S.fonticola)(NR_116808)、百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)(BX470248)和副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)(BX470249)等。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 LR12基因组 DNA的提取采用试剂盒法，试验操作根据说明书进行。基因组DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，置于-20℃保存备用。

1.2.2 16S rDNA序列的克隆 克隆LR12菌株16S rDNA的上游与下游PCR引物分别为YFUP(5’-GGGCACTCACAAGACCGTAT-3’)和YFDN(5’-GACAATCTGTGTGAGCACTTCA-3’)。PCR反应总体积为 20 μL，在PCR管中依次加入无菌ddH2O 15.6 μL、10× Taq酶缓冲液2.0 μL、10 mmol/L的dNTPs 0.4 μL、20 μmol/L的上下游引物各0.45 μL、25 ng/μL细菌DNA 0.5 μL和2 U/μL Taq DNA聚合酶0.6 μL。PCR程序：95℃预变性5 min；95℃ 30 s，55.9℃ 45 s，72℃ 2 min，共33个循环；循环结束后，72℃继续延伸10 min。

1.2.3 PCR产物的回收、连接和转化 PCR产物经电泳检测后，采用试剂盒法回收DNA片段。回收产物与2 ×连接缓冲液、pGEM-T Easy载体(Promega)和T4DNA连接酶混合，用量分别为2.5 μL、5.5 μL、0.5 μL和1 μL，混匀后置于室温连接2 h。用热激法将其导入DH5α感受态细胞，经涂布培养、挑取单菌落和菌液PCR检测后，选取3份菌液用于测序。

1.2.4 16S rDNA序列的比较 为明确LR12与其他细菌的关系,与下载自NCBI的14个细菌的16S rDNA进行比较。经多重比对后，采用邻接法(Neighbor-joining method)用MEGA X构建系统发育树，经1 000次自举检测。

2 结果与分析

2.1 16S rDNA序列的克隆

以YFUP/YFDN为引物对，利用PCR法克隆到清晰、单一的条带，大小约1 700 bp，与预期基本一致(图1)。经回收、连接、转化和测序，得到核苷酸序列，PCR产物序列长度为1 714 bp，截去两端序列后得到16S rDNA序列，全长为1 551 bp，GC为53.9%(图2)。

注：M为DNA分子量标准；1～4为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种16S rDNA的PCR产物。
Note：M，DNA marker；1～4，PCR products of 16S rDNA ofP.carotovorumsubsp.carotovorum.
图1LR12菌株 16S rDNA序列的克隆
Fig.1 Cloning of 16S rDNA sequence of strain LR12

2.2 序列比对

序列比对结果表明，LR12的16S rDNA序列与胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的相似性达100%，与巴西亚种的相似性达99.9%。多重序列比对结果表明，15种细菌16S rDNA的大部分区域十分保守，但也存在一定的插入/缺失、转换或颠换现象(图2)。产气克雷伯氏菌与其他14种细菌相比，在+26 bp处存在G碱基的插入；S.glossinae和居泉沙雷氏菌在+44 bp处有1个碱基的缺失，而同属的水生沙雷氏菌在该位置的碱基为A，菊欧文氏杆菌香蕉致病变种为T，其他细菌为C；居泉沙雷氏菌和水生沙雷氏菌在+51 bp处存在碱基颠换现象，在该位置的碱基为C，而其他细菌为G。博德特氏菌属2种细菌的16S rDNA与其他细菌差异较大，+34～+37 bp和+48～+49 bp处分别有3～4个和1～2个碱基的插入；+42 bp和+43 bp存在G↔C颠换现象，+59 bp存在T↔C转换现象。LR12菌株与胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种在16S rDNA上的差异较小，仅存在2个碱基的差异，而且均为A↔G转换(图3)。

2.3 系统发育树

从图4看出，15条序列的总遗传距离为0.08。LR12与其他细菌之间的遗传距离为0.001～0.218，其中，与胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种之间的遗传距离最小；与P.polaris次之，为0.012；与百日咳博德特氏菌的遗传距离最大。15种细菌在系统发育树上可分为5组，分别分属于果胶杆菌属(I)、克雷伯氏菌属(II)、狄克氏菌属(III)、沙雷氏菌属(IV)和博德特氏菌属(V)。LR12与胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种的关系最近，二者聚在同一亚组，支持率达100%，并与另外2种果胶杆菌属细菌聚于组I，但支持率仅为67%。

3 结论与讨论

3.1 结论

以绿萝叶腐病菌株LR12为材料，在提取DNA的基础上，利用PCR法克隆其16S rDNA，并借助生物信息学技术进行分析。LR12菌株的16S rDNA全长1 551 bp，GC达53.9%，该序列与胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的相似性最高，为100%，与巴西亚种的相似性次之，达99.9%。系统发育结果表明，15种细菌在发育树上可分为5组，分组与传统分类结果吻合。绿萝叶腐病病原菌胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种16S rDNA的克隆与分析为后续开展分子鉴定和生产应用奠定了基础。

3.2 讨论

果胶杆菌属由10余种细菌组成，其中的果胶杆菌(P.carotovorum)有4个亚种，分别为胡萝卜亚种(supsp.carotovorum)、巴西亚种(subsp.brasiliense)、odoriferum亚种和猕猴桃亚种(subsp.actinidiae)等[10]。该属细菌在侵染植物时，能产生大量的果胶酶、多聚半乳糖醛酸酶、纤维素酶和蛋白酶等，用于降解和破坏植物的细胞壁，使植物组织发生软腐[11]。果胶杆菌属细菌的寄主十分广泛，能危害多种蔬菜、果树和观赏植物。王信等从马铃薯(Solanumtuberosum)软腐组织中分离到1种病原菌，结合形态、生理生化和分子方法，鉴定为山葵果胶杆菌。黄瓜细菌性软腐病发生在叶片、茎、叶柄和果实等部位，出现流胶和湿腐现象，经鉴定该病害由胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种引起[12]。王茜等[13]从芹菜(Apiumgraveolens)中分离到1株病原菌，该细菌在实验室条件下能侵染叶柄，在温室条件下引起芹菜软腐症状，经鉴定，该病原菌为胡萝卜软腐果胶杆菌odoriferum亚种。胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的寄主范围更广，对作物的危害更大，其被列为农业生产十大病害之一[14]。台州学院生命科学学院分子生物学实验室前期从绿萝叶片中分离到1株病原细菌，经离体鉴定，该病原菌能引起绿萝叶片和叶柄发生软腐，结合形态和生化特征，认为该细菌为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种。

与形态学、生理生化等标记相比，分子标记具有稳定性高、重复性好、操作简便和多态性高等优点，近年来在细菌分类鉴定中得到广泛应用。rDNA是一种重要的分子标记，兼具可变性和保守性等特点，高变性能反映物种的核苷酸序列特征，可用于种属的区分[15]。16S rDNA则是细菌分子鉴定常用的rDNA序列，在果胶杆菌属的分类鉴定中得到广泛应用。董海龙等[16]从西葫芦(Cucurbitapepo)茎基软腐病病株中分离到病原菌，经测定16S rDNA，鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种。王晓丽等[17]利用通用引物扩增朝鲜蓟(Cynarascolymus)根茎腐烂病病原菌的16S rDNA序列发现，其与NCBI中胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的16S rDNA相似性高达93%。MEJA-SNCHEZ等[18]等利用16S rDNA鉴定了龟甲柱(Neobuxbaumiatetetzo)腐烂病的病原菌，该序列与胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种有99%的相似性。GAO等[19]从药用植物独角莲(Typhoniumgiganteum)软腐病株中分离病原菌，其16S序列与胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种有99%的相似性。笔者等测定了绿萝LR12菌株的16S rDNA，该序列与胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的相似性达100%，证实绿萝叶腐病由该亚种引起。