紫草素对睾丸癌细胞I-10和精原细胞瘤TCAM-2侵袭、迁移的影响

姚 越,汤玉锐,张 冲,韩 兵,熊言骏,汪 盛

(蚌埠医学院第一附属医院泌尿外科,蚌埠 233000;*通讯作者,E-mail:bydoctorw@163.com)

睾丸癌(testicular cancer)多发于18-39岁之间的青少年和年轻人,5年相对生存率为95%[1]。目前,肿瘤转移是导致癌症患者死亡的主要因素[2],占睾丸癌患者的90%以上[3],同时非转移性癌症患者应采用相同的化学疗法治疗转移性肿瘤[4]。肿瘤侵袭和迁移的危害包括死亡,耐药性[5,6]和术后复发。因此,寻找可以抑制肿瘤侵袭和迁移的药物至关重要。

紫草素是一种活性蒽醌衍生物,得自紫草紫苏根。临床和药理特性研究已证实,紫草素在多种炎性和传染病中具有抗发炎、抗氧化、抗血栓形成和降血糖作用[7,8]。近来,紫草素作为抗肿瘤剂的研究引起了人们的注意,目前紫草素已用于治疗各种癌症,包括肺癌[9]、胰腺癌[10]和子宫内膜癌[11]。最近,一些文献表明,紫草素可以抑制癌细胞的侵袭和转移[12],基质金属蛋白酶家族(MMPs)是细胞外基质降解必需的锌离子依赖性的内源性蛋白酶,可以特异性降解基底膜成分[13]。MMPs中的明胶酶是唯一能够降解基底膜和细胞外基质中的Ⅵ型胶原成分的酶,其中的MMP-2和MMP-9发挥着重要的作用,与肿瘤内血管生成、侵袭及转移相关[14]。上皮型钙黏附蛋白(E-cadherin)是重要的上皮细胞黏附分子,E-cadherin黏附功能的丧失与肿瘤细胞的发生发展、侵袭过程密切相关[15],目前尚未有紫草素对睾丸癌细胞I-10、TCAM-2的作用研究,本实验主要探讨紫草素对睾丸癌细胞I-10、TCAM-2侵袭和迁移的影响,同时探讨其可能的作用机制,为临床治疗下睾丸癌提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

人睾丸癌I-10、TCAM-2细胞购自上海细胞库,DMEM培养基、胰蛋白酶购自公司美国Hyclone公司,胎牛血清(FBS)购自浙江天杭生物科技股份有限公司,紫草素粉末(HPLC≥98%,Lot#:C10245876)购自上海麦克林生化科技有限公司,MTT试剂、Transwell小室及BCA蛋白定量试剂盒购于上海碧云天公司,MMP-2、MMP-2、E-cadherin、β-actin蛋白抗体购自美国CST公司。

1.2 细胞培养

人睾丸癌细胞I-10、TCAM-2培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基中,37 ℃、5% CO2恒温培养。

1.3 MTT测定细胞增殖

将I-10、TCAM-2细胞悬液(1×104/ml)分别接种到96孔板,调整每孔培养液为100 μl,培养24 h,I-10细胞中加入浓度分别为0,1.2,1.4,1.6 μmol/L的紫草素,TCAM-2细胞中加入紫草素浓度分别为0,0.5,1.0,1.5 μmol/L,分别于培养24,48,72 h时每孔加入15 μl MTT溶液,继续培养4 h,小心吸去培养液,每孔加入150 μl DMSO,继续培养30 min待甲臜完全溶解,用酶联免疫检测仪测吸光度值(OD490nm)。计算细胞存活率:细胞存活率(%)=实验组OD490nm/对照组OD490nm×100%。取平均值绘制药物剂量效应曲线,计算药物的半数抑制浓度(IC50)。

1.4 Transwell检测细胞侵袭能力

将Materigel胶与预冷的无血清DMEM培养基按1 ∶8的比例稀释,每孔加入60 μl Materigel胶均匀覆盖Transwell小室底部,培养60 min使之呈半凝固态。分别取对数生长期的I-10、TCAM-2细胞,消化离心后,用无血清培养基重悬计数,I-10细胞组每个内室内加入100 μl紫草素药物浓度分别为0,1.2,1.4,1.6 μmol/L的细胞悬液,TCAM-2细胞组每个内室内加入100 μl紫草素药物浓度分别为0,0.5,1.0,1.5 μmol/L的细胞悬液,每孔均含1×105个细胞。于24孔板即外室中加入600 μl含10% FBS的DMEM培养基,每组均设3个复孔。于37 ℃、5% CO2、饱和湿度下培养48 h;取出小室,PBS清洗2次,4%多聚甲醛固定15 min,用1%结晶紫染液室温下染色10 min;PBS漂去多余染料,光镜下每孔随机取5个视野拍照,计数并求平均值,侵袭抑制率(%)=(1-实验组细胞侵袭个数/空白对照组细胞侵袭个数)×100%。

1.5 Transwell迁移实验

除无需铺基质胶外,其余处理步骤同1.4中所述,所有实验重复3次,迁移抑制率(%)=(1-实验组细胞迁移个数/空白对照组细胞迁移个数)×100%。

1.6 Western blot法检测蛋白表达水平

分别将对数期生长状态良好的I-10、TCAM-2细胞以不同浓度(1.2,1.4,1.6 μmol/L)的紫草素处理48 h,收集细胞,冰上裂解30 min,12 000 r/min离心30 min,取上清液;每组取60 μg蛋白进行SDS-PAGE分离,转至聚偏氟乙烯膜;快速封闭液封闭15 min,PBST溶液洗膜3次,5 min/次;4 ℃一抗过夜,TPBS溶液洗膜3次,兔抗(使用TPBS 1 ∶5 000稀释)室温下孵育2 h,TPBS溶液洗膜3次,5 min/次,ECL试剂盒暗室发光显影,凝胶成像系统获取图像。

1.7 统计学分析

实验数据采用SPSS21.0统计软件进行统计分析,实验数据均以均数±标准差表示,多组比较采用单因素方差分析及两因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 紫草素对I-10、TCAM-2细胞的增殖抑制作用

MTT结果显示,当紫草素浓度逐渐增加时,I-10和TCAM-2细胞的存活率逐渐降低(见图1);且随时间(24,48,72 h)的变化,I-10、TCAM-2细胞存活率也逐渐降低(P<0.05)。I-10细胞24,48,72 h的IC50分别为1.939,1.379,0.824 μmol/L,TCAM-2细胞24,48,72 h的IC50分别为1.874,1.031,0.724 μmol/L,表明紫草素对I-10、TCAM-2细胞的作用具有浓度依赖性和时间依赖性,与对照组比差异具有统计学意义(P<0.05,见图1)。

与0 μmol/L比较,*P<0.05图1 不同浓度紫草素对I-10、TCAM-2细胞增殖的抑制作用Figure 1 Inhibition effect of shikonin on proliferation of I-10 and TCAM-2 cells

2.2 紫草素对I-10、TCAM-2细胞迁移和侵袭能力的影响

Transwell侵袭和迁移实验结果显示,与对照组相比,1.2,1.4,1.6 μmol/L紫草素作用于I-10细胞侵袭抑制率分别为(26.2±2.2)%,(50.1±4.0)%和(74.2±2.6)%,迁移抑制率分别为(60.3±3.4)%,(82.3±2.3)%和(89.8±3.4)%(见图2)。0.5,1.0,1.5 μmol/L紫草素作用于TCAM-2细胞侵袭抑制率分别为(17.3±2.1)%,(48.1±2.9)%和(69.2±3.3)%,迁移抑制率分别为(67.6±3.3)%,(83.3±2.7)%和(92.8±1.2)%,与对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.05,见图2)。表明紫草素可以抑制I-10、TCAM-2细胞侵袭和迁移活性。

与0 μmol/L比较,*P<0.05图2 紫草素对I-10、TCAM-2细胞迁移和侵袭能力的影响Figure 2 Effect of shikonin on migration and invasion of I-10 and TCAM-2 cells

2.3 紫草素对I-10、TCAM-2细胞MMP-2、MMP-9及E-cadherin表达影响

检测结果表明,紫草素可随剂量依赖性的同时下调I-10、TCAM-2细胞中与侵袭迁移相关的MMP-2、MMP-9及E-cadherin蛋白的表达(P<0.05,见图3)。

与0 μmol/L比较,*P<0.05图3 紫草素对I-10、TCAM-2细胞MMP-2、MMP-9及E-cadherin表达的影响Figure 3 Effect of shikonin on the expression of MMP-2, MMP-9 and E-cadherin in I-10 and TCAM-2 cells

3 讨论

肿瘤细胞的黏附、迁移、侵袭能力是在肿瘤细胞的转移中起重要作用的3个关键因素。越来越多的证据表明,细胞侵袭对癌症的进展至关重要,涉及肿瘤细胞向邻近组织的迁移和侵袭以及细胞外基质蛋白的溶解[16]。

紫草素主要通过抑制细胞增殖发挥抗肿瘤活性用于治疗各种癌症,同时紫草素对TPC-1细胞系的甲状腺乳头状癌细胞(PTC)和胃癌(GC)细胞迁移水平有影响,且没有明显的肝毒性[17]。本实验结果表明,紫草素可抑制睾丸癌细胞I-10、TCAM-2的增殖及侵袭迁移。为了探究紫草素抑制I-10、TCAM-2细胞侵袭迁移的机制,本研究使用Western blot法检测紫草素作用I-10、TCAM-2细胞后检测与肿瘤侵袭迁移相关蛋白如MMP-2、MMP-9、E-cadherin的相对表达水平,基质金属蛋白酶家族(MMPs)已被用作体内流体转移的诊断标志物,MMP-2和MMP-9被认为是两个重要的促成因素,与肿瘤的生长和肿瘤的转移有关,在临床和动物实验观察到肿瘤细胞MMP-2和MMP-9的高表达水平[18,19]。E-cadherin蛋白是评估肿瘤细胞迁移能力的重要分子标志物,是转移抑制分子,其水平增高将降低癌细胞的迁移能力[20],结果表明紫草素能够同时下调I-10和TCAM-2细胞MMP-2、MMP-9和上调E-cadherin的表达抑制其侵袭迁移。

综上所述,本研究证明了紫草素能够抑制睾丸癌细胞I-10、TCAM-2增殖和侵袭迁移,抑制侵袭迁移的机制可能为下调侵袭迁移相关蛋白MMP-2、MMP-9和上调E-cadherin的表达,有望成为治疗睾丸癌的有效策略。