TIPE3蛋白在宫颈鳞癌中的表达及其与EMT的相关性

魏 星,冀 静,赵永林

(1西安交通大学第二附属医院妇产科,西安 710004;2西安交通大学第一附属医院妇产科;3西安交通大学第二附属医院肿瘤科;*通讯作者,E-mail:zhaoyonglinlin@163.com)

宫颈癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤,发病率和死亡率均居女性肿瘤第二位,严重危害着女性的健康[1]。宫颈癌的发生发展是多因素综合作用的结果,尽管目前宫颈癌的预防和治疗取得了很大进展,例如HPV疫苗、新的宫颈癌筛查技术等可预防并早期筛查出宫颈癌,但是宫颈癌发生发展的机制仍有待进一步探索。

前期研究发现宫颈癌组织内高表达神经胶质成熟因子γ,且其可能与宫颈癌细胞的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程有关[2]。进一步蛋白组学发现TIPE3即TNFAIP8L3(tumor necrosis factor α-induced protein 8 like 3)是神经胶质成熟因子γ的下游分子。TIPE3是新近研究发现的促肿瘤分子,可通过捕获磷脂酰肌醇4,5-二磷酸和磷酸肌醇3,4,5-三磷酸使磷脂酰肌醇3-激酶/AKT通路激活,影响肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭和转移[3]。TIPE3在乳腺癌、肝细胞肝癌、食管癌和非小细胞肺癌等肿瘤组织中的表达高于癌旁组织[4-6],但目前尚未见到TIPE3在宫颈癌中表达情况的报道,仅有研究发现TIPE3在HeLa细胞系中的表达量相对较低[7],探索TIPE3在宫颈癌中的表达及其意义有助于揭示宫颈癌发生发展的新机制。

宫颈癌侵袭、转移是导致患者死亡的主要原因,EMT使宫颈癌细胞获得较高的迁移、侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力,是宫颈癌获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程[8]。本研究拟探讨宫颈癌组织中TIPE3的表达,并探讨其与EMT关键蛋白的相关性,为揭示宫颈癌的病理生理机制提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 标本收集

本研究所用宫颈癌组织标本均来自2012-01～2013-06西安交通大学第一附属医院妇产科初诊宫颈鳞癌的患者,共30例,临床分期Ⅰ-Ⅱ期,术前经活检确诊,均未接受放化疗。对照组为同时期30例因子宫良性病变行全子宫切除术患者的正常宫颈,术后病理均证实无宫颈病变[2]。

1.2 主要试剂

TIPE3抗体购自美国Abcam公司,E-cadherin及Vimentin单克隆抗体均购自美国proteintech公司,SP检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司。

1.3 免疫组织化学法检测TIPE3、E-cadherin、Vimentin的表达

所有标本经多聚甲醛固定后常规包埋、切片、二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化,高压法抗原修复,37 ℃山羊血清封闭,TIPE3抗体(1 ∶100)、E-cadherin抗体(1 ∶100),Vimentin抗体(1 ∶200)4 ℃孵育过夜;PBS洗脱一抗,二抗37 ℃孵育1 h,辣根过氧化物酶孵育30 min,DAB显色,苏木素复染,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判定

每张切片随机选取3个有代表性的高倍视野,免疫组化评分采用染色强度评分、阳性细胞数百分比评分综合评价,二者评分乘积为最终结果。①染色强度评分:无染色0分,轻度黄染1分,中度黄染2分,重度黄染3分;②阳性细胞数百分比=(阳性表达的肿瘤细胞数/所有肿瘤细胞数)×100%;评分:<10%为0分,10%-24%为1分,25%-49%为2分,50%-74%为3分,75%-100%为4分。评分0-4分为低表达,6-12分为高表达,高表达判定为表达阳性,低表达判定为表达阴性。

1.5 统计分析

所有资料均由SPSS18.0软件分析处理,计数资料采用Pearson卡方检验,计量资料采用Wilcoxon秩和检验,相关性分析采用Spearman列联系数检验,检验水准取α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TIPE3、E-cadherin及Vimentin在宫颈鳞癌及正常宫颈组织中的表达

宫颈鳞癌中的TIPE3蛋白主要表达在癌细胞的细胞浆,正常宫颈组织中TIPE3蛋白仅分布于基底膜细胞的细胞浆(见图1)。TIPE3在宫颈鳞癌组织中的阳性表达率(70.0%,21/30)显著高于正常宫颈组织(16.7%,5/30),差异具有统计学意义(P=0.001,见表1)。

E-cadherin在宫颈癌组织中主要分布于部分癌细胞,而在正常宫颈组织中主要分布在基底膜细胞的细胞膜(见图1)。宫颈鳞癌组织中E-cadherin的阳性表达率(30.0%,9/30)显著低于正常宫颈组织(66.7%,20/30),差异具有统计学意义(P=0.004,见表1)。Vimentin蛋白主要分布在宫颈癌及正常宫颈组织的间质组织(见图1),其在宫颈鳞癌组织中的阳性表达率(70.0%,21/30)显著高于正常宫颈组织(40.0%,12/30),差异具有统计学意义(P=0.020,见表1),结果提示宫颈癌中存在EMT过程。

图1 宫颈鳞癌及正常宫颈组织中TIPE3、E-cadherin及Vimentin的表达Figure 1 Expression of TIPE3, E-cadherin and Vimentin in cervical squamous carcinoma tissue and normal cervical tissue

表1 TIPE3、E-cadherin及Vimentin在宫颈鳞癌及正常宫颈组织中的表达(例)

Table 1 Expression of TIPE3, E-cadherin and Vimentin in cervical squamous carcinoma tissue and normal cervical tissue(cases)

组别nTIPE3E-cadherinVimentin低表达高表达P低表达高表达P低表达高表达P宫颈鳞癌309210.0012190.0049210.020正常宫颈3025510201812

2.2 宫颈组织中TIPE3与EMT表达的相关性分析

宫颈组织中,TIPE3和E-cadherin的表达呈负相关,Spearman列联系数为-0.265(P=0.023);TIPE3和Vimentin的表达呈正相关,Spearman列联系数为0.354(P=0.003);而E-cadherin和Vimentin的表达呈负相关,Spearman列联系数为-0.457(P=0.000,见表2)。结果提示,宫颈癌组织中异常高表达的TIPE3可能参与了肿瘤的EMT过程。

表2 TIPE3与E-cadherin、Vimentin表达的相关性分析

Table2 Correlation analysis between E-cadherin, Vimentin and TIPE3

组别TIPE3E-cadherinVimentinrPrPrPTIPE3---0.2650.0230.3540.003E-cadherin-0.2650.023---0.4570.000Vimentin0.3540.003-0.4570.000--

3 讨论

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤,具体发病机制仍不明确,既往研究发现宫颈癌的不良预后与癌细胞的侵袭和转移密切相关。EMT与宫颈癌的关系是近年研究的热点,对EMT进行干扰或阻断,成为抗肿瘤治疗新的有效靶点,能极大改善宫颈癌患者预后、延长患者生存期,但目前其机制尚未确切。

TIPE3是磷脂酰肌醇第二信使的转运蛋白[9]。本研究发现在宫颈癌组织中,TIPE3主要表达在宫颈鳞癌的细胞浆内,且TIPE3在宫颈鳞癌组织中的表达显著高于正常宫颈组织,提示TIPE3在宫颈癌中表达上调,其可能参与了宫颈癌的发生和进展。与本研究结果相似,既往研究也发现TIPE3在乳腺癌、肝细胞肝癌、食管癌和非小细胞肺癌等多种肿瘤组织中的表达高于癌旁组织,并且在人NCI-H727肺癌细胞、T24膀胱癌细胞以及HT-29结肠癌细胞系中的表达也升高,而下调TIPE3的表达,能减少肿瘤细胞数量;提示TIPE3在体外能促进肿瘤细胞生长[10]。既往研究发现TIPE3在HeLa细胞系中表达量相对较低[7],与既往研究结果不同,本研究发现TIPE3在宫颈癌中表达较高,其原因可能在于宫颈癌病理类型常见的有鳞癌、腺癌和腺鳞癌三种类型,本研究的宫颈癌标本为鳞癌,而HeLa细胞系被证实来源于腺癌,故表达有差异,且关于TIPE3在宫颈癌中表达的研究较少,其表达情况仍需进一步研究。

E-cadherin是构成上皮细胞间黏附的重要成分,可使癌细胞从原发病灶中脱离,向周围淋巴结转移或侵入血管向远处转移。Vimentin是一种中间丝蛋白,主要表达于正常或肿瘤性间叶组织细胞中。Vimentin异常表达增多使细胞骨架蛋白构成改变,易于迁移游动。E-cadherin表达的降低、Vimentin表达的异常升高被认为是EMT程序启动的主要分子标识。本研究发现,宫颈癌中上皮黏附蛋白标记物E-cadherin表达下降,而间质标记物分子Vimentin表达上调,提示宫颈癌中存在EMT,与既往结果一致。进一步结果表明:E-cadherin与Vimentin的表达呈负相关;TIPE3与E-cadherin的表达呈负相关,与Vimentin的表达呈正相关,提示在宫颈癌中,高水平的TIPE3与宫颈癌细胞的EMT相关,其可能通过EMT降低细胞的黏附作用,促进癌细胞的转移。TIPE3可使磷脂酰肌醇3-激酶/AKT通路激活,进而影响肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭和转移[4]。既往研究发现通过下调肺癌细胞、膀胱癌细胞以及结肠癌细胞中TIPE3的表达,可导致肿瘤细胞数量减少;但过表达TIPE3可加快细胞周期,促进肿瘤细胞生长。TIPE3缺失能够抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,其表达量在高侵袭性乳腺癌细胞系中更高。此外,TIPE3可调节AKT和NF-κB通路,并能提高MMP-2和u PA的表达水平,进而激活AKT和NF-κB通路,而AKT和NF-κB通路的激活可促进宫颈癌细胞EMT的发生[11,12]。

综上,本研究发现TIPE3在宫颈癌中的表达上调,且与EMT相关蛋白E-cadherin的表达呈负相关,与Vimentin的表达呈正相关,提示宫颈癌中异常高表达的TIPE3可能参与了宫颈癌细胞的EMT,促进了肿瘤细胞的转移。