芦可替尼靶向抑制肝星状细胞活化的作用及机制

律 玲,阴继凯,张 章,董 瑞,鲁建国,王 栋*

(1空军军医大学附属唐都医院预防保健科,西安 710038;2空军军医大学附属唐都医院普通外科;*通讯作者,E-mail:wdyt021@126.com)

肝硬化引起的入肝血流机械性阻力增加是肝内型门静脉高压症的最初和根本原因之一。肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)是肝纤维化细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的主要合成细胞,其活化与增殖是肝纤维化过程发生发展的中心环节[1,2],因此有效抑制HSC活化增殖是治疗肝纤维化的重要靶点之一。JAK/STAT通路是一条多种细胞因子共用的信号传导途径,在JAK的4个亚型和STAT 7种亚型中JAK2/STAT3通路是最重要的通路之一,其广泛参与细胞增殖、分化、凋亡以及免疫调节等生理过程[3]。多种研究表明通过抑制JAK/STAT通路可以明显抑制HSC活化过程,但尚无临床应用的药物出现。芦可替尼(ruxolitinib)是一种新型JAK1和JAK2选择性抑制口服靶向药物,目前临床主要应用于骨髓纤维化治疗的靶向治疗[4],相关研究也多集中在骨髓纤维化等血液系统疾病,但是在肝脏相关疾病研究极少,因此本研究尝试探讨芦可替尼对HSC活化增殖过程等细胞行为的影响,以期为肝硬化门静脉高压症的治疗探索新的可能的治疗途径。

1 材料与方法

1.1 材料

原代大鼠HSC购于Sciencell公司;p-JAK2抗体、JAK2抗体、p-JAK1抗体、JAK1抗体、p-STAT3抗体、STAT3抗体、cyclin D1抗体、cleaved caspase-3抗体购于Abcam公司;α-SMA抗体购于Santa Cruz公司;CCK8检测试剂盒购于日本同仁公司;胎牛血清购于Gibco公司。

1.2 实验方法和步骤

1.2.1 HSC的培养 大鼠原代HSC接种于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,在37 ℃、5%CO2及饱和湿度下培养,当原代培养的HSC铺满培养瓶底面积的80%左右时开始传代。调整细胞密度为2.5×105个/ml,每孔加入2 ml,加入6孔板中,放置在37 ℃、5% CO2培养箱中培养至单层细胞。

1.2.2 实验分组及确定最佳药物干预条件 以p-JAK2/JAK2蛋白表达评价JAK2通路激活程度,以α-SMA蛋白表达评价HSC活化程度。将HSC分为空白对照组(NC)、IL-6实验对照组和IL-6+ruxolitinib实验组。分别加入IL-6(20 ng/ml)和IL-6(20 ng/ml)+ruxolitinib(25,50,75 μmol/L),检测ruxolitinib不同浓度及时间下对JAK2通路及HSC活化程度的影响。IL-6组于IL-6作用后24 h进行处理细胞,提取蛋白进行Western blot检测p-JAK2/JAK2及α-SMA表达。IL-6+ruxolitinib(25,50,75 μmol/L)组分别在干预12,24,48 h后处理HSC并提取蛋白后行Western blot检测HSC中p-JAK2蛋白、JAK2蛋白及α-SMA蛋白表达量。

1.2.3 免疫荧光染色 常规方法培养细胞,用4%多聚甲醛固定;PBS漂洗3次,加入封闭液室温封闭30 min后PBS清洗后加入用PBS-TX(含0.4% Triton X-100的PBS溶液)稀释的α-SMA单克隆抗体一抗稀释液(稀释比例1 ∶200),4 ℃过夜;PBS-TX洗3次,加入二抗稀释液,室温避光孵育1 h;加入用PBS-TX稀释的DAPI室温染色3 min;弃去DAPI,PBS-TX漂洗后在载玻片上加上抗淬灭剂,在倒置荧光显微镜下观察。

1.2.4 Western blot检测 常规方法提取细胞蛋白并将浓度调整一致,JAK1、p-JAK1、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、α-SMA、COL1A1、cyclin D1、cleaved caspase-3抗体的工作浓度分别为1 ∶200、1 ∶200、1 ∶100、1 ∶200、1 ∶100、1 ∶200、1 ∶1 000、1 ∶500、1 ∶200、1 ∶400。蛋白条带扫描后计算目标蛋白与相应内参比值。

1.2.5 CCK-8细胞增殖检测 按日本同仁公司(DOJINDO CO.,Ltd,JAPAN)CCK8检测试剂盒说明书检测步骤进行检测。

1.2.6 Transwell侵袭实验 取出Transwell小室放置在24孔培养板里,Transwell小室内外加入少许无血清培养基,润化10 min左右。用BD的基质胶1 ∶40稀释(无血清培养基),然后在每个小室中加入100 μl,在37 ℃条件下放置1 h。常规消化HSC细胞,用无血清培养基稀释至1×105个/ml,取200 μl的HSC细胞悬液加入Transwell小室(小室孔径8 μm),24孔下室中加入500 μl含10%胎牛血清的培养基,避免气泡产生。24 h后取出Transwell小室,PBS冲洗3次,清除微孔膜内层细胞后用70%酒精固定5 min,PBS冲洗2次,0.1%结晶紫染色30 min,去离子水中洗3遍,取10个视野观察并求平均值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 确定芦可替尼最佳干预条件及分组

通过不同条件下处理HSC细胞后用Western blot检测HSC中p-JAK2/JAK2及α-SMA的表达情况,结果见图1。芦可替尼(75 μmol/L)干预24 h后p-JAK2/JAK2及α-SMA表达显著下降,最终确定IL-6活化的HSC用芦可替尼75 μmol/L作用24 h即可达到显著抑制JAK2通路及降低HSC活化程度的实验目的。因此确定实验分组为空白对照(NC)组、IL-6(20 ng/ml)组和IL-6(20 ng/ml)+ruxolitinib(75 μmol/L)组,干预时间24 h。

1.control组;2.IL-6组;3-5.分别为IL-6+25,50,75 μmol/L Ruxo组作用12 h;6-8.分别为IL-6+25,50,75 μmol/L Ruxo组作用24 h;9-11.分别为IL-6+25,50,75 μmol/L Ruxo组作用48 h图1 Western blot检测芦可替尼干预后肝星状细胞胞内蛋白表达Figure 1 Western blot analyses of protein expression in HSC after ruxolitinib treatment

2.2 Western blot检测HSC中各蛋白的表达程度

Western blot检测IL-6(20 ng/ml)组、IL-6+ruxolitinib(75 μmol/L)组及对照组(NC)细胞中p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3、COL1A1、cyclin D1、cleaved caspase-3蛋白表达情况,结果见图2。IL-6组中p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3、COL1A1、cyclin D1的蛋白表达均明显高于NC组(P<0.05);IL-6+ruxolitinib组中p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3、COL1A1、cyclin D1的蛋白表达较IL-6组明显降低(P<0.05),而cleaved caspase-3的表达明显增高(P<0.05);NC组与IL-6组中cleaved caspase-3蛋白表达无显著差异(P>0.05)。

图2 芦可替尼(75 μmol/L)干预24 h肝星状细胞中各种蛋白表达情况Figure 2 Western blot analysis of protein expression in HSC after ruxolitinib(75 μmol/L) treatment for 24 h

2.3 免疫荧光染色检测HSC中α-SMA蛋白表达

免疫荧光染色检测HSC中α-SMA蛋白表达,以各组平均积分光密度(IOD)作为结果进行分析,结果显示IL-6组中α-SMA表达较NC组明显升高(142.6±19.5vs86.1±9.3,P<0.05);IL-6+ruxolitinib(75 μmol/L)组中α-SMA表达较IL-6组显著降低(34.1±31.0vs142.6±19.5,P<0.05,见图3)。

图3 免疫荧光染色检测HSC中α-SMA蛋白表达Figure 3 Expression of α-SMA protein in HSC by immunofluorescence

2.4 芦可替尼对HSC细胞增殖的影响

用CCK-8检测细胞活性,结果显示,IL-6组的细胞存活率显著高于IL-6+ruxolitinib组,并具有统计学差异(P<0.05,见图4)。ruxolitinib对细胞活性产生了明显的抑制作用。

与IL-6组比较,*P<0.05图4 CCK-8检测芦可替尼对HSC细胞增殖的影响Figure 4 Effect of ruxolitinib on the proliferation of HSC by CCK-8

2.5 芦可替尼对HSC细胞侵袭性的影响

Transwell趋化性显微照相显示:IL-6组透膜的细胞数目较对照组明显增多(438.1±93.7vs295.2±76.1,P<0.05),而IL-6+ruxolitinib组透膜的细胞数目与IL-6组相比较显著减少,差异有统计学意义(167.6±41.8vs438.1±93.7,P<0.05,见图5)。

图5 Transwell实验检测芦可替尼对HSC细胞侵袭性的影响Figure 5 Effect of ruxolitinib on the invasiveness of HSC by Transwell analysis

3 讨论

肝脏纤维化是在肝脏受到损伤刺激后的一种自我修复的代偿性反应过程,HSC被认为是参与肝纤维化过程的关键细胞。有研究表明抑制HSC活化及增殖并促进HSC的凋亡可以有效缓解肝纤维化进程,因此是治疗肝纤维化可能的有效靶点之一[5]。JAK2/STAT3通路被认为是HSC活化的重要细胞通路之一[6,7],有效抑制该通路可明显抑制HSC活化,我们先前的研究也证实这一点,但目前临床无针对抑制肝纤维过程的靶向药物。芦可替尼是新型选择性抑制JAK1和JAK2口服药物,是目前唯一获批用于骨髓纤维化治疗的靶向药物,也在我国临床应用[4]。芦可替尼针对JAK1和JAK2具有高度的选择性抑制作用,同时对tyrosine kinase 2(TYK2)也具有温和的抑制作用,但在肝脏相关疾病中研究甚少。Shaker等[8]和Hazem等[9]报道芦可替尼预处理可明显降低硫代乙酰胺诱导的肝脏毒性作用,其主要机制是抑制肝脏JAK/STAT通路缓解肝细胞死亡,降低肝脏氧化应激及炎症反应。另外,芦可替尼可通过抑制JAK1-STAT3通路抑制肝细胞内急性时相蛋白(hepatic acute phase proteins,APP)表达降低肝细胞炎性反应[10],因此芦可替尼对HSC活化过程的抑制作用存在理论上的可能。

HSC在活化过程中发生表型改变,其早期即在组织炎症坏死区域向肌成纤维细胞(myofibroblast,MFB)转型并持续激活,并成为肝脏ECM的主要来源细胞,α-SMA蛋白表达可作为HSC活化的重要标志[11]。IL-6通过激活JAK2/STAT3通路活化HSC是经典的HSC激活通路[12,13],IL-6活化HSC后加入芦可替尼可明显降低HSC中p-JAK1/2、p-STAT3蛋白表达,表明芦可替尼对HSC中JAK1/2-STAT3通路具有明显抑制作用,免疫荧光实验进一步表明芦可替尼明显降低α-SMA蛋白阳性的HSC数量,提示芦可替尼可以通过对JAK1/2-STAT3通路的抑制作用降低HSC活化进程。Ⅰ型胶原蛋白(collagen type Ⅰ,COL1A1)是肝纤维化细胞外基质的主要组成成分,活化后的HSC成为Ⅰ型胶原蛋白的主要合成细胞,Western blot实验显示芦可替尼干预后HSC中COL1A1表达明显下降,提示芦可替尼干预后HSC合成细胞外基质的合成能力下降,从而降低肝纤维化过程。

减少HSC侵袭性增加HSC凋亡程度同样是抑制肝纤维化的重要环节[14],激活的JAK2/STAT3通路可通过调节下游靶基因具有抗细胞凋亡[15]和促进细胞增殖的作用[16]。cyclin D1是重要的细胞周期活性蛋白,其可调控细胞从G1期向S期转变[17]。caspase-3蛋白在细胞凋亡中发挥关键作用,细胞发生凋亡后caspase-3蛋白转变为cleaved caspase-3蛋白进一步促进细胞凋亡转变[18]。本实验发现芦可替尼干预后HSC中cyclin D1蛋白表达下降、cleaved caspase-3蛋白上调表明芦可替尼抑制了HSC增殖能力并促进HSC凋亡。CCK-8实验和Transwell趋化性实验进一步验证了芦可替尼通过抑制JAK1/2-STAT3通路抑制HSC增殖和侵袭能力。

综上所述,本研究证实芦可替尼对HSC中JAK1/2-STAT3通路的活化具有强烈的抑制作用,并进一步降低HSC活化、增殖及侵袭细胞生物行为,减少细胞外基质的合成,抑制肝脏纤维化过程。因此明确芦可替尼对HSC具有靶向抑制作用,并可能成为临床治疗肝纤维化的有效靶向药物。