复方山楂煎剂对非酒精性脂肪肝大鼠模型的影响*

李 月 李 想

(1.辽宁中医药大学附属医院,沈阳 110032)(2.中国医科大学肿瘤医院、辽宁省肿瘤医院，沈阳 110042)

脂肪肝是指由于各种原因引起脂肪在肝细胞内堆积的病变[1]。脂肪肝正严重威胁人类的健康，成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，脂肪肝已被公认为隐蔽性肝硬化的常见原因。脂肪肝是一种常见的临床现象，而非一种独立的疾病，其临床表现轻者无症状，重者病情严重。一般而言脂肪肝属可逆性疾病，早期诊断并及时治疗常可恢复正常[2]。复方山楂煎剂组成：山楂50 g，延胡索15 g，丹参30 g，菊花15 g，红花15 g，麦芽40 g。用法：每日1剂，文火煎至300 mL，分3次口服，其功能主治为：活血行气，化浊散瘀，用于治疗高脂血症、脂肪肝及冠心病等[3]，有研究表明复方山楂煎剂治疗高血脂症30例,疗效满意,可显著降低患者血清总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)含量[4-5]。在此我们通过实验观察复方山楂煎剂对非酒精性脂肪肝的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级Wistar大鼠60只，雌雄各半，体质量180～220 g, 购于辽宁长生生物有限公司，合格证号：SCXK(辽)2015-0001。大鼠饲养于辽宁中医药大学实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK(辽)2014-0004。温度：22～25 ℃,湿度：55%～60%。

1.2 药品和试剂

复方山楂煎剂(辽宁中医药大学附属医院制剂室提供,批号20170804)；脂必妥片(成都地奥九泓制药厂生产，批号20170319)；丙基硫氧嘧啶(上海复星朝辉药业有限公司，批号20161208)；胆酸钠(中国医药上海化学试剂公司，批号F20170428)；胆固醇(上海如吉生物科技发展公司，批号20160622)；猪油市售；TG试剂盒(购自长春汇力生物技术有限公司，批号20170409)； ALT、AST、MDA、SOD、试剂盒(购自南京建成生物工程研究所，批号20170831)，肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)抗体和结缔组织生长因子抗体(connective tissue growth factor, CTGF)(购自北京博奥森生物技术有限公司)。PBS磷酸缓冲盐(购自北京索莱宝科技有限公司)；TMS-P超敏试剂盒(购自福建迈新生物技术开发有限公司)；DAB显色剂(购自福建迈新生物技术开发有限公司)。

1.3 实验仪器

U-3010紫外可见分光光度计，日本岛津；CX-7型全自动生化分析仪，美国Beckman公司生产；YG-280KX型摊片机和YG-280KX型烤片机，湖北孝感市阳光神琦医用科技有限公司；BX43型光电显微镜，奥林巴斯中国有限公司；JKDP2型电热恒温培养箱，厦门医疗电子仪器厂。RM2235型切片机、TP1020型自动脱水机，德国(徕卡)；JTS-3B型电子秤，厦门懿恒电子有限公司；HWS-100F型恒温恒湿培养箱，上海丙林电子科技有限公司；PHS-3G型pH计，武汉天壹力仪器设备有限公司。

1.4 方法

1.4.1造模及给药:购入大鼠后适应饲养1周，按体质量大小获得原始编号，再按随机数字表随机分成空白对照组、模型对照组、复方山楂煎剂14.85 g生药/kg低剂量组，29.7 g生药/kg中剂量组，59.4 g生药/kg高剂量组，脂必妥1.5 g/kg阳性药物对照组。每组10只，雌雄各半。空白对照组喂饲普通饲料，其余各组喂饲高脂饲料[4-5](胆固醇5%、猪油15%、丙基硫氧嘧啶0.2%、胆酸钠0.2%)8周后，空白对照组、模型对照组灌胃蒸馏水，各给药组灌胃相应药物，1次/d，容积为10 mL/kg，治疗给药6周。治疗给药6周后各组大鼠禁食不禁水14 h后称重，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg),腹主动脉取血后，取肝脏称重并计算肝体比(肝体比=肝脏质量/体质量×100%)，血液于室温静置1 h后离心分离血清，按试剂盒说明操作检测血清MDA、SOD、ALT、AST的活性。每只大鼠取肝脏的相同部位0.1 g匀浆后提取上清液用于肝组织中TG的含量的测定。另取相同部位肝组织用福尔马林固定，进行HE染色，采用免疫组化法检测肝组织中肝细胞生长因子(HGF)及结缔组织生长因子(CTGF)的表达。

1.4.2肝组织HE染色:切片常规脱蜡，用苏木精染色5 min，1%盐酸乙醇分化，0.5%伊红液染色5 min，梯度脱水，透明，中性树胶封片，在显微镜下观察肝细胞脂肪变性程度。

1.4.3免疫组化法检测肝脏组织中HGF及CTGF的表达:切片脱蜡至水后。采用3% H202室温孵育15 min，用于消除内源性过氧化物酶活性。使用蒸馏水洗1次，再用PBS缓冲溶液浸洗3次，每次5 min。滴加10%的山羊血清，于室温下孵育10 min后倾去血清。然后滴加一抗(HGF 稀释比例为1∶300，CTGF 稀释比例为1∶350)，于37 ℃恒温培养箱中孵育2 h。PBS缓冲溶液浸洗3次，每次5 min。滴加生物素标记的二抗，于37 ℃恒温培养箱中孵育30 min。PBS缓冲溶液浸洗3次，每次5 min。滴加辣根酶标记的链霉素工作液，37 ℃恒温培养箱中孵育30 min。PBS缓冲溶液浸洗3次，每次5 min。最后滴加DAB显色剂显色，自来水冲洗，苏木精复染，脱水，二甲苯透明后采用中性树胶封片。使用ImageJ软件对免疫组化图片进行灰度值分析。

1.5 统计方法

2 结果

2.1 复方山楂煎剂对血液生化指标影响

经喂饲高脂饲料造模后，与空白对照组相比，模型对照组血清MDA、ALT、AST显著升高(P<0.01),与空白对照组相比模型对照组血清SOD显著降低(P<0.01)。各给药组经6周治疗后，与模型对照组相比各给药组血清中MDA、ALT较模型对照组显著降低(P<0.05或P<0.01)，复方山楂煎剂中剂量组、高剂量组、脂必妥组血清中AST显著降低(P<0.05或P<0.01)，复方山楂煎剂中剂量组、高剂量组血清中SOD显著升高(P<0.01)，见表1。

2.2 复方山楂煎剂对肝脏TG含量及肝体比的影响

经8周喂饲高脂饲料后，模型对照组肝脏中TG显著增多，肝体比显著增加(P<0.01)，与模型对照组相比各给药组经6周治疗后肝组织中TG含量及肝体比显著降低(P<0.05或P<0.01)(表2)。

表1 复方山楂煎剂对血清中MDA含量以及SOD、ALT、AST活力的影响Table 1 Effect of Shanzha decoction on MDA content and SOD, ALT, AST activity in

表2 复方山楂煎剂对肝体比及肝脏中甘油三酯含量的影响Table 2 Effect of Shanzha decoction on liver weight coefficient and liver

2.3 复方山楂煎剂对在肝脏组织中脂肪病变的影响

与空白对照组相比模型对照组肝脏组织中脂肪泡明显增大，与模型对照组相比复方山楂煎剂各组、脂必妥组肝脏组织中脂肪泡有所减小，见图1。

图1 HE染色(×200)注：A：空白对照组；B：模型对照组；C：复方山楂煎剂低剂量组；D：复方山楂煎剂中剂量组；E：复方山楂煎剂高剂量组；F：脂必妥组Fig. 1 HE staining (× 200)Note：A:Blank control group;B:Model control group;C: Shanzha decoction Low dose group；D:Shanzha decoctionmiddle dose group;E:Shanzha decoction high dose group;F:Zhibituo group

2.4 复方山楂煎剂对HGF及CTGF在肝脏组织中表达的影响

与空白对照组相比模型对照组肝脏组织中HGF及CTGF表达显著增加(P<0.01)，与模型对照组相比复方山楂煎剂中剂量组、剂量组、脂必妥组肝脏组织中HGF表达显著降低(P<0.05或P<0.01)，与模型对照组相比复方山楂煎剂各剂量组、脂必妥组肝脏组织中CTGF表达显著降低(P<0.05或P<0.01)，见表3、图2、图3。

表3 各组肝脏组织中HGF及CTGF表达(灰度值)的比较Table 3 Comparison of HGF and CTGF expression in liver

图2 大鼠肝细胞生长因子表达的结果(×200)注：A：空白对照组；B：模型对照组；C：复方山楂煎剂低剂量组；D：复方山楂煎剂中剂量组；E：复方山楂煎剂高剂量组；F：脂必妥组Fig. 2 Results of rat HGF expression in liver tissue(× 200)Note：A:Blank control group;B:Model control group;C: Shanzha decoction Low dose group；D:Shanzha decoction middle dose group;E:Shanzha decoction high dose group;F:Zhibituo group

图3 大鼠结缔组织生长因子的结果(×200)注：A：空白对照组；B：模型对照组；C：复方山楂煎剂低剂量组；D：复方山楂煎剂中剂量组；E：复方山楂煎剂高剂量组；F：脂必妥组Fig. 3 Results of rat CTGF expression in liver tissue(×200)Note：A:Blank control group;B:Model control group;C: Shanzha decoction Low dose group；D:Shanzha decoctionmiddle dose group;E:Shanzha decoction high dose group;F:Zhibituo group

3 讨论

复方山楂煎剂中所含山楂、延胡索、丹参、菊花、红花、麦芽均可入肝经，具有消食、祛瘀、活血、行气、止痛的功效，用于胸胁胀满、脘腹疼痛等与脂肪肝密切相关的病症，复方山楂煎剂用量为每剂165 g，每日1剂，根据人与大鼠药物剂量转换系数得出大鼠给药生物等效量为14.85 g生药/kg，设14.85 g生药/kg为本研究的低剂量，中剂量为低剂量2倍，高剂量为中剂量2倍。本项目研究了复方山楂煎剂对高脂饮食诱发大鼠脂肪肝形成的影响。HE染色结果显示模型对照组肝细胞内出现明显的透明空泡是肝细胞脂肪变性引起的，经HE染色后肝组织内的脂肪被洗脱，所以HE染色后在肝组织内留下透明的空泡，空泡越明显，脂肪肝变性越严重[6]，而复方山楂煎剂各组较模型组肝组织脂肪变性明显减轻，说明采用活血行气，化浊散瘀法治疗脂肪肝效果显著。

氧化应激引起的改变可能在脂肪肝中起重要作用[7]。MDA等过氧化脂质可使细胞膜的流动性和通透性发生障碍，引起细胞功能失调甚至破裂[8]。由于ALT位于肝细胞浆中，AST在肝细胞线粒体，当肝细胞膜及内质网线粒体等内膜系统有任何细微的改变都能影响其通透性，ALT、AST向肝血窦溢出，可导致血清ALT、AST活性增加[9]。ALT、AST活性的变化是肝细胞损伤的晴雨表，脂质过氧化物可引起肝细胞炎性损伤[10]。非酒精性脂肪肝模型组大鼠MDA、ALT及AST活性比空白对照组显著升高，表明脂质过氧化，引起了肝细胞的损伤，复方山楂煎剂各治疗组，血清MDA、ALT及AST活性显著减低，表明复方山楂煎剂对非酒精性脂肪肝大鼠模型确有抗氧化，减轻肝细胞损伤，降低ALT、AST活性的作用。

肥胖者由于脂肪量增加，激素敏感性脂肪酶活化，故合成TG增加，当TG合成速度超过极低密度脂蛋白(VLDL)分泌速度时就会引起脂肪肝形成[11]。SOD 是一种金属酶，主要存在于胞质、溶酶体、过氧化体及线粒体内，是机体抗氧化损伤防御体系中的最重要的抗氧化酶之一，不仅能特异的清除超氧化自由基，而且能催化超氧阴离子自由基使之歧化为过氧化氢，再通过过氧化氢酶的作用使之转变成无毒性的水，从而保护细胞免受氧代谢物的损伤[12]。文献显示灌胃给予120 mg/kg山楂黄酮可显著降低高脂血症大鼠血清丙二醛的含量，增强红细胞和肝脏超氧化物歧化酶的活性，同时增强全血谷胱甘肽还原酶活性，从而提高抗氧化能力，抑制脂质过氧化物，预防脂代谢紊乱，山楂黄酮可以有效地保护给药后大鼠肝脏细胞，使肝脏细胞损伤程度明显降低[13]。本研究中复方山楂煎剂可显著提高其血清SOD活力，同时可显著降低脂肪肝大鼠肝脏TG含量，并使其肝体比显著降低。

脂肪在肝脏中累积，然后引起慢性肝细胞损伤造成氧化应激[14]，氧化应激反应导致肝细胞发生凋亡或激活局部免疫反应，进而促进炎症反应[15]。因此肝脏转化脂肪时是容易遭受损伤、坏死的过程[16]，肝脏细胞损伤必然引起肝脏的再生过程加速，虽然肝脏具有超强的再生能力，但是肝脏的强大修复能力也具有潜在的风险，如果因为高脂饮食导致脂肪肝而使肝脏受到持续损伤，肝脏反复的修复也可以让肝癌的发生的概率增加[17]。 肝细胞生长因子(HGF)是一种可调节多种细胞生长的多功能因子。在肝脏损伤后具有启动肝再生的功能，HGF刺激原代无血清培养的肝细胞DNA的合成，对多种组织器官的生长发育有重要的生理调节功能。HGF能促进血管内皮细胞再修复[18]。肝细胞生长因子(HGF)调节胶原纤维的合成和炎性反应，在致癌作用等方面发挥重要作用[19]。肝纤维化是慢性肝病发展到肝硬化的必经阶段，结缔组织生长因子(CTGF)因具有明显的趋化性，能诱导成纤维细胞增殖。肝星状细胞(HSC)是CTGF主要来源，而CTGF表达上调，也是HSC活化的中心环节。因此CTGF在肝纤维化发生发展中起着重要的作用。本研究中复方山楂煎剂组可显著降低HGF及CTGF在脂肪肝模型大鼠肝组织中的表达，因此可以降低脂肪肝向肝纤维化及肝癌发展的概率。

本研究结果表明复方山楂煎剂可降低血脂水平，减轻肝组织氧化应激反应，减少了HGF及CTGF在脂肪肝模型大鼠肝组织的表达，复方山楂煎剂对非酒精性脂肪肝具有积极的治疗作用。