大鼠颈总动脉球囊拉伤模型的制作研究*

王 威 张颖倩 李中轩 周 瑾 陈韵岱

(1. 解放军总医院第一医学中心心内科，北京 100853)(2.解放军总医院第七医学中心心内科，北京 100700)(3.解放军总医院第八医学中心卫勤部，北京 100094)

经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention, PCI)是改善冠脉缺血的重要手段，但球囊扩张、支架置入等介入操作会对血管内壁产生机械损伤，影响内皮细胞层的完整性和内皮功能，这是PCI术后支架内再狭窄(in-stent restenosis, ISR)和支架内血栓形成的病理基础，使得介入治疗的远期效果明显受限。大鼠颈总动脉球囊拉伤模型是目前应用最广泛的ISR动物模型，经皮冠状动脉腔内成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)球囊导管是制作模型的关键用具，目前的研究对体质量区间在200～400 g的大鼠多采用直径2.0 mm的球囊导管进行模型制作[1-3]。为进一步提高造模效率，我们试用更小口径的球囊导管(1.5 mm)制作模型，以期探索出一种更稳定更高效的模型制作方法，为ISR的病理生理研究以及进一步的治疗提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康成年雄性SD大鼠25只，体质量300～350 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK(京)2016-0006。本研究所涉及的所有动物实验均符合相关规定与伦理学要求，实验方案得到了中国人民解放军总医院实验动物福利伦理委员会的批准，严格按照国家质量监督检验检疫总局、国家标准委2018年发布的《实验动物福利伦理审查指南》相关伦理原则以及中国人民解放军总医院实验动物福利伦理委员会之动物实验伦理及动物福利相关规定执行。

1.2 实验仪器

2.0 mm×15 mm PTCA球囊导管(美国Cordis公司)，1.5 mm×15 mm PTCA球囊导管(美国Cordis公司)，显微手术器械(动脉夹、眼科剪、镊子、玻璃分针、手术缝合针线等)。

1.3 实验试剂

0.5%伊文氏蓝(中国Coolaber公司)，磷酸缓冲盐溶液(Phosphate Buffered Saline, PBS)(美国HyClone公司)，戊巴比妥钠(德国merck公司)，丁丙诺啡(天津药物研究院药业有限公司)。

1.4 方法

1.4.1实验动物分组:将25只大鼠随机分为假手术组3只，大球囊组11只、小球囊组11只，大球囊组应用2.0 mm×15 mm PTCA球囊导管进行模型制作，小球囊组应用1.5 mm×15 mm PTCA球囊导管进行模型制作。假手术组仅做颈外动脉分离、切开，未行球囊导管插入。所有模型制作由同一操作者在1周内完成，应用不同型号球囊的模型制作交替进行。大球囊组、小球囊组两组在体质量、数量上均无统计学差异。

1.4.2大鼠颈总动脉球囊拉伤模型的制作:SD大鼠禁食8 h，称体质量，腹腔注射4%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉，仰卧位固定，颈部备皮、75%酒精消毒，于颈部正中自下颌至胸骨柄上缘经皮做一直切口，钝性纵向分离腺样体、胸骨舌骨肌和右侧胸骨乳突肌，暴露右侧颈总动脉，沿右侧颈总动脉向远心端游离至颈总动脉的“Y”型分叉状结构(颈总动脉上行至这里分为颈内动脉和颈外动脉)，暴露颈内动脉和颈外动脉。4-0丝线临时结扎颈内动脉和颈外动脉远心端，动脉夹夹闭颈总动脉近心端，在颈外动脉远心端结扎处与颈总动脉“Y”型分叉口之间用眼科剪在颈外动脉做一切口，将球囊导管(大球囊组2.0 mm×15 mm，小球囊组1.5 mm×15 mm)自切口插入颈外动脉，打开动脉夹，将球囊导管进一步插入至颈总动脉根部(共插入约3 cm)，均以1.0个大气压将球囊充盈，缓慢拉回球囊至“Y”型分叉，将球囊抽真空，并再次插入至颈总动脉根部，然后再次充盈、拉回，反复3次，每次插入前旋转球囊120°。3次拉伤完毕后撤出球囊并在“Y”型分叉处结扎颈外动脉，解开颈内动脉临时结扎处，恢复颈总动脉、颈内动脉血流，确认颈总动脉搏动良好、血流通畅，逐层缝合颈部切口。术后予丁丙诺啡(0.05 mg/kg，皮下注射，2次/d，连续用药3 d)止痛。饲养14 d，喂养用水和饲料为清洁水和标准饲料。

1.4.3伊凡氏蓝染色验证模型：将各组存活的大鼠在造模手术14 d后称体质量，腹腔注射4%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉，股静脉注射0.5%伊文氏蓝1 mL/100 g，30 min后，手术取材右侧颈总动脉(剪取无名动脉发出段到“Y”型分叉段)，取材后动物在麻醉状态下放血处死。右侧颈总动脉用PBS洗涤后沿长轴纵向剖开、铺平，观察可见球囊拉伤之非内皮化区域为伊文氏蓝染色呈蓝色，内皮化区域无法蓝染而呈白色。采集图像并通过ImageJ 1.52a软件计算蓝色区域面积与总面积的比值。

1.5 统计方法

2 结果

2.1 造模成功率比较

大球囊组11例，回拉球囊时颈总动脉断裂致术中死亡3例，插管困难出血过多致术中死亡3例，最终造模成功5例(成功率45.5%，5/11)。小球囊组11例，插管困难出血过多致术中死亡1例，最终造模成功10例(成功率90.9%，1/11)。见表1。

表1 两组颈总动脉球囊拉伤模型制作情况比较Table 1 The successful establish rate of carotid artery balloon-injured model in two groups

2.2 两组内膜损伤面积占比的比较

球囊拉伤之非内皮化区域为伊文氏蓝染色呈蓝色，内皮化区域无法蓝染而呈白色(图1)。大球囊组蓝色区域面积与总面积的比值平均值为0.56，标准差为0.18。小球囊组蓝色区域面积与总面积的比值平均值为0.50，标准差为0.13。两组比较无统计学差异，t=0.823，P=0.426。

图1 两组内皮损伤面积比较(伊凡氏蓝染色)Fig.1 The area of injured endothelium in two groups (Ivans’ blue staining)

3 讨论

经皮冠状动脉介入治疗是治疗冠心病最有效的手段之一，但介入操作中的支架置入和球囊扩张产生的摩擦、压迫等机械损伤以及随之而来的局部血流的涡流、震荡流均会影响血管内皮的功能和完整性[4-5]。血管内皮由具有抗凝、抗炎、调节血管张力、保持血管通畅等作用的单层内皮细胞构成的一层完整结构[6]。内皮的损伤和再内皮化的延迟是PCI术后出现支架内血栓等并发症的重要原因，限制了PCI术的临床效果，而且支架血栓的发生并没有因新一代药物涂层支架的应用而得到改善[7- 8]。加速再内皮化、修复内皮完整性、改善内皮功能是降低支架术后并发症风险的重要靶点[9]。为进一步研究这些问题，最常用的动物模型就是大鼠颈总动脉球囊拉伤模型。近年来大多数研究中，行颈总动脉球囊拉伤模型制作的大鼠体质量常在200～400 g，而相应造模的球囊常选用2.0 mm甚至2.5 mm的球囊导管[10-13]。使用2.0 mm的球囊导管进行模型制作，在将导管插入颈总动脉后，以1.0～2.0个大气压充盈球囊、拉回导管时，常常产生很大阻力，若拉回导管速度过快则易造成动脉离断，若速度过慢又延长了动脉血流阻断的时间，增加了动脉血栓形成等造模失败的风险。近年来，有学者尝试在体质量600 g的雄性SD大鼠中使用1.5 mm的球囊导管和体质量350～400 g的雄性SD大鼠中使用1.25 mm的球囊导管进行模型制作并获得成功[14-16]。为进一步验证使用小口径球囊导管进行模型制作能否提高造模成功率并取得与大口径球囊导管一样的动脉内膜损伤效果，我们设计了本研究。在研究中，我们在相近体质量300～350 g的大鼠中分别应用了1.5 mm和2.0 mm的球囊导管，研究发现小口径的球囊导管可以显著提高造模的成功率，且可以实现与大口径球囊导管无明显差异的动脉内膜损伤效果，为再内皮化的相关动物实验研究提供了一种更为高效可靠的模型制作方法。