玛咖复合黄精和桔梗调节糖脂代谢作用的研究

2020-03-22李爱民冯秋琪吴晓磊丁方莉桑若杰段盛林高晓冬

食品与生物技术学报 2020年12期

李爱民，冯秋琪，柳嘉，吴晓磊，林静，丁方莉，夏凯，苑鹏，桑若杰，万宁，段盛林，高晓冬

（1. 江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；2. 江南大学生物工程学院，江苏无锡214122；3. 新时代健康产业（集团）有限公司，北京102206；4. 功能主食创制与慢病营养干预北京市重点实验室，北京100015；5. 中国食品发酵工业研究院有限公司，北京100015）

经济发展使人们的饮食结构发生了巨变，以往的粗粮、粗加工、低脂低糖食品逐渐被精细加工的高糖高脂食品所替代。长期摄入高脂高糖食品会直接导致肥胖，同时伴随一系列代谢综合征，如高血糖、高血脂、胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）和氧化应激等，严重时可发展为一系列代谢疾病，如糖尿病（diabetes mellitus，DM）、非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）和心脑血管疾病等[1-2]。其中氧化应激和IR 是上述多种代谢疾病共同症状，是研究代谢疾病的关键所在。

近年来，人们对药食同源的天然资源进行研究，发现一些植物中的活性成分可通过其抗氧化、清除自由基以及缓解炎症的作用，来改善糖脂代谢[3-5]。玛咖（Lepidium meyeniiWalp）为十字花科独行菜属一年或两年生草本植物，原产于秘鲁，是当地的一种保健食品。 2002 年中国引种玛咖，目前已在云南丽江和新疆等地种植。玛咖作为新食品资源，在市场上已经有各种类型的产品，其功效有抗疲劳、调节神经、改善性功能、缓解更年期综合征等[6]。黄精为百合科黄精属多年生草本植物的干燥根状茎，在我国各省均有广泛分布，是一种传统滋补中药，味甘，性平，归脾、肺、肾经，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾的功效。黄精的主要活性成分有黄精多糖、皂苷、黄酮和挥发油等，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化以及降血糖等功效[7]。桔梗为桔梗目桔梗科多年生草本植物，是我国药食同源的传统中药，有祛痰止咳、消炎和提高免疫力的作用。桔梗中主要的药理活性成分是皂苷类，此外还含有黄酮、酚类、多糖、甾体等一些活性成分[8]。研究结果还表明，玛咖、黄精和桔梗的水提物均具有一定的抗氧化、调节代谢的功效[9-11]。黄远英等[12]通过建立小鼠疲劳模型，发现黄精和玛咖组成的复方含片可增加小鼠肝糖原的含量，并降低血乳酸水平，具有一定的缓解体力疲劳的作用。也有相关的专利报道，黄精玛咖组成的复方食品，可缓解人体疲劳并增强免疫力[13-14]。王瑜玲等[15]公开了一种黄精复合桔梗等药食同源的植物提取物的配方，具有降血糖的功效，可作为辅助降血糖的食品配方。作者在以往研究的基础上，对玛咖、黄精和桔梗的活性成分分别进行提取，并采用高糖高脂诱导HepG2 细胞，建立糖脂代谢紊乱的细胞模型，从多个指标评价玛咖和黄精-桔梗提取物复配对糖脂代谢的调节作用，探究其作用机制及复方的最佳配比，以期为玛咖功能组方干预代谢疾病提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玛咖：新时代健康产业（集团）有限公司产品；黄精和桔梗：北京同仁堂有限责任公司产品；HepG2细胞株：中国食品发酵工业研究院提供；Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）培养基、磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline，PBS）、平衡盐缓冲液（Hank’s balanced salt solution，HBSS）、DMEM 无糖培养基、小牛血清：美国Gibco 公司产品；油酸（Oleic acid，OA）、棕榈酸（Palmitic acid，PA）、2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）、二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、噻唑兰（3-（4，5-dimethylthiazol -2 -yl） -2，5 -diphenylterazolium bromide，MTT）、胰蛋白酶、二甲双胍：美国Sigma 化学公司产品；无游离脂肪酸（FFA）、牛血清白蛋白（FFA-free bovine serum albumin，BSA）：日本WAKO公司产品；RIPA 细胞裂解液、TG 试剂盒、葡萄糖试剂盒、糖原试剂盒、TC 试剂盒：碧云天生物技术研究所提供；氯仿、正丁醇、碳酸钠、无水乙醇：均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

高速多功能粉碎机：德清拜杰有限公司产品；旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂制造；真空冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司产品；CKX41 倒置生物显微镜：日本OLympus 公司产品；生物安全柜：中国济南鑫贝西生物技术有限公司产品；MCO-20AIC CO2细胞培养箱：松下健康医疗器械公司产品；Spectra Max i3 酶标仪：美国MD 公司产品；电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司产品；超声波清洗仪：昆山超声仪器有限公司产品；pH 计：上海雷磁仪器厂制造；GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂制造；DK-8D 三温三控水槽：上海博迅实业有限公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 玛咖、黄精和桔梗水提物的制备取一定量的玛咖、黄精和桔梗干燥后机械粉碎，过60 目筛。 3个样品各取40 g，按照料液比1 g∶20 mL 加入到60 ℃蒸馏水中，搅拌均匀，超声波（功率250 W）辅助提取30 min，提取液经过4 000 r/min 离心15 min，取上清液，将沉淀再次加入等量蒸馏水超声辅助提取一次，再次离心15 min，合并上清液后，利用旋转蒸发浓缩至每个样品体积为200 mL；加入氯仿-正丁醇（3∶1，体积比）溶液，使样品液与有机相溶液体积比为1∶3～1∶4，振摇30 min 后，3 000 r/min 离心5 min，中间层为变性的游离蛋白层，分离两相，使蛋白质全部去除；水相中再加入其三分之一体积的有机溶液，重复2 次，有机相合并后可加水使得体积比为3∶1～4∶1， 3 000 r/min 离心10 min，上清液与所有水相合并在一起后冷冻干燥，得到3 个样品的水提物备用[16-18]。

1.3.2 造模液的配制称取一定量BSA，溶于无糖无酚红不完全DMEM 培养基中，用10 mol/L 的氢氧化钾调pH 值至10，并超声至澄清。称取一定量的油酸和棕榈酸，溶于少量含BSA 相应不完全培养基中，使得FFA 溶液中油酸与棕榈酸的摩尔比例为2∶1，同时FFA 与BSA 的摩尔比例为6.6∶1，超声至澄清。将BSA-FFA 复合物溶液pH 值调至7.4，用0.22 μm 过滤器过滤除菌。然后加入称取的一定量的葡萄糖和果糖，混合均匀，再次进行过滤除菌，即得到所需造模液，于-20 ℃保存备用，使用前孵育至37 ℃[19-20]。

1.3.3 样品的配制 MTT 用样品的配制：将黄精水提物和桔梗水提物按照质量比为1∶1 混合得到黄精-桔梗水提混合物，称取一定量的玛咖水提物和黄精-桔梗水提混合物，分别溶于无血清的DMEM培养基，配制成10 mg/mL 的模型组用母液，用0.22 μm 过滤器过滤除菌。将配制的2 个样品置于4 ℃冰箱备用。样品的配制：将黄精水提物和桔梗水提物按照质量比为1∶1 混合，得到黄精-桔梗水提混合物，称取一定量的玛咖水提物和黄精-桔梗水提混合物，分别溶于配制好的造模液中，配制成10 mg/mL 的母液，用0.22 μm 过滤器过滤除菌后置于4 ℃冰箱备用。

1.3.4 MTT 法测定细胞存活率 HepG2 细胞培养于含新生牛血清10%（体积分数）、青霉素100 U/mL和链霉素100 μg/mL 的DMEM 培养基中（下文简称DMEM10），于温度为37 ℃、CO2体积分数为5%以及相对湿度为90%的培养箱中常规培养。当细胞生长至80%～90%融合时，移除旧培养液，用PBS 溶液润洗细胞层后用胰蛋白酶消化细胞，在显微镜下观察细胞呈圆形时，吸出胰酶，加入3 mL DMEM10 终止胰蛋白酶消化反应，将细胞用移液枪吹打成细胞悬液[21]。取96 孔培养板，每孔加100 μL 细胞悬液，HepG2 细胞浓度为1×105个/mL，37 ℃培养24 h 后弃去培养液，用PBS 清洗1 次，每孔加入不同浓度的处理液100 μL，以含质量分数1% BSA 的DMEM培养基孵育细胞为对照。培养24 h 后除去培养液，加入0.5 mg/mL MTT-DMEM 于37 ℃避光孵育4 h，再加入100 μL DMSO，震荡混匀以完全溶解MTT紫色结晶产物。用酶标仪在490 nm 处测定吸光度值，并以对照组细胞的细胞存活率为100%计算其余组别的细胞存活率[22]。

1.3.5 细胞葡萄糖摄取能力的测定各组细胞加样处理24 h 后，弃去培养液，用PBS 洗1 次，换为葡萄糖浓度为12.5 mmol/L 的DMEM 培养基，培养12 h 后取5 μL 上清液，用葡萄糖测定试剂盒测定葡萄糖含量，计算葡萄糖消耗量[20]。

1.3.6 细胞内糖原含量的测定各组细胞加样处理24 h 后，小心弃去培养液，用PBS 洗1 次，细胞用RIPA 裂解液裂解，用糖原试剂盒测定胞内糖原含量。结果除以蛋白质含量后，换算为与对照组的百分比为最终表示结果。

1.3.7 上清液及细胞内TG、TC 含量的测定各组细胞加样处理24 h 后，取50 μL 待测细胞上清液，用TG 试剂盒测定TG 含量，结果以模型组TG 含量的百分比表示（%）。

各组细胞加样处理24 h 后，小心弃去培养液，将板内待测定细胞用PBS 润洗2 次后，加入RIPA裂解液。充分裂解后，用TG 试剂盒和TC 试剂盒测定TG 和TC 的含量，结果以模型组TG 和TC 含量的百分比表示（%）[19]。

1.3.8 细胞内ROS 水平测定将处理的细胞用含有25 μmol/L DCFH-DA 的HBSS 在37 ℃条件下培养30 min，然后用HBSS 清洗2 次后加入100 μL的HBSS。用酶标仪测定96 孔黑板中荧光物质的发射光，结果以模型组ROS 水平的百分比表示（%）[23]。

1.3.9 统计学处理实验数据采用Origin 8.0 统计软件进行分析，结果以平均值±标准误差（±SD）表示。并对实验结果进行单因素显著性分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 玛咖、黄精和桔梗水提物的提取率

分别称取玛咖、黄精和桔梗各40 g，水提后，得到玛咖、黄精和桔梗的水提物的干质量分别为12.12、18.4、16.36 g。计算可得，玛咖，黄精以及桔梗水提物均有较高的提取率，分别为30.3%、46.0%、40.9%。

2.2 玛咖复合黄精和桔梗对细胞增殖的影响

采用不同质量浓度的玛咖和黄精-桔梗混合物处理细胞24 h，由图1 可知，玛咖在质量浓度为1 mg/mL 时，细胞存活率与对照组相比没有显著差异；2 mg/mL 时，细胞存活率与对照组相比显著降低（P＜0.05）。因此，在后续实验中，玛咖的上样质量浓度不得超过1 mg/mL。同理，黄精-桔梗混合物的后续最大上样质量浓度也应为1 mg/mL。玛咖和黄精-桔梗混合物以体积比1∶1 复配后，质量浓度为0～2 mg/mL 时，细胞存活率与对照组相比无显著差异，而当质量浓度大于2 mg/mL 时，细胞存活率显著下降。因此得出，2 mg/mL 应为玛咖和黄精-桔梗混合物以体积比1∶1 复配后上样的最大质量浓度。

图1 玛咖和黄精-桔梗提取物处理24 h 对细胞增殖的影响Fig. 1 Effects of maca and HJJG extract on cell proliferation after 24 h treatment

2.3 玛咖复合黄精和桔梗对糖脂代谢紊乱细胞糖吸收和胞内糖原含量的影响

由图2（a）可知，与模型组相比，玛咖单独作用时，仅在高剂量质量浓度1 mg/mL 时能够显著降低细胞上清液葡萄糖含量（P＜0.05），而黄精-桔梗混合物在中（0.5 mg/mL）、高剂量（1 mg/mL）时均能够显著降低细胞上清葡萄糖含量（P＜0.05）。此外，玛咖和黄精-桔梗混合物不同比例复配后的上清液葡萄糖含量均低于单独作用时的含量，当玛咖和黄精-桔梗混合物以1 mg/mL 质量浓度复配时，上清液葡萄糖含量降低最显著，下降约30%（P＜0.05）。从图中还可看出，玛咖和黄精-桔梗混合物高质量浓度复配时，其促进细胞糖吸收的活性与阳性对照MET相当。由图2（b）可知，玛咖单独作用时在低、中、高质量浓度时对细胞内糖原水平均无显著影响，黄精-桔梗混合物仅在高剂量质量浓度1 mg/mL 时能够显著提高胞内糖原相对含量（P＜0.05），而复配后的结果显示，高质量浓度黄精-桔梗混合物与低、中、高质量浓度玛咖分别复配时，其细胞内糖原相对含量均高于单独作用的相对含量；中、高质量浓度的玛咖与中质量浓度的黄精-桔梗混合物，高质量浓度的玛咖与低质量浓度的黄精-桔梗混合物虽在单独作用时对细胞内糖原无显著影响，但复配后均能显著提高细胞内糖原相对含量（P＜0.05），且高质量浓度的玛咖和高质量浓度的黄精-桔梗复配混合，细胞内糖原相对含量最高。由以上可以得出，玛咖和黄精-桔梗混合物复配后能够显著促进细胞葡萄糖吸收及胞内糖原转化，具有调节糖代谢紊乱的作用，且当1 mg/mL 的玛咖和1 mg/mL 的黄精-桔梗混合物复配时，调节细胞糖代谢紊乱的效果最佳。

图2 玛咖和黄精-桔梗混合物对糖脂代谢紊乱细胞上清液葡萄糖和胞内糖原的影响Fig. 2 Effects of maca and HJJG on supernatant glucose and intracellular glycogen with glucose-lipid metabolism disorder

2.4 玛咖复合黄精和桔梗对糖脂代谢紊乱细胞胞内TG、TC 和上清液TG 的影响

由图3（a）可知，加样处理24 h 后，与模型组相比，玛咖和黄精-桔梗混合物单独和复配后的样品处理细胞，其胞内TG 水平无显著性差异（P＞0.05）。由图3（b）可知，玛咖单独作用时，在中、高质量浓度均能显著提高上清液TG 相对含量（P＜0.05），黄精-桔梗混合物在高质量浓度时，能够显著提高上清液TG 相对含量（P＜0.05）。而复配结果显示，玛咖和黄精-桔梗混合物在低质量浓度复配时对细胞上清液TG 相对含量无显著影响，在中、高质量浓度复配时均可显著提高细胞上清液TG 相对含量（P＜0.05）。胞外TG 含量升高的原因是由于细胞糖吸收增加，促进了TG 的合成以及胞内TG 的排出[22]。由图3（c）可以看出，中质量浓度玛咖复配高质量浓度黄精-桔梗混合物以及高质量浓度玛咖复配高质量浓度黄精-桔梗混合物均能够显著降低细胞内TC 相对含量（P＜0.05），其中高质量浓度玛咖和高质量浓度黄精-桔梗混合物复配效果最好，细胞内TC 含量下降了约11%。其可能是通过抑制TC 的合成或促进TC 的分解，实现降低TC 水平[19，23]。综上可知，玛咖和黄精-桔梗混合物复配分别为MH+HJM、MM+HJH、MH+HJH 组合时，可显著提高胞外TG 水平，并显著抑制胞内TC 含量，TC 是引起血脂异常的一个重要指标，因此，玛咖和黄精-桔梗混合物复配分别为MH+HJM、MM+HJH、MH+HJH 组合时，可显著调节细胞脂代谢，其中玛咖与黄精-桔梗混合物质量浓度分别为1 mg/mL 进行复配时，调节脂代谢的效果最佳。

图3 玛咖和黄精-桔梗混合物对糖脂代谢紊乱细胞内TG，TC 和细胞上清液TG 的影响Fig. 3 Effects of maca and HJJG on intracellular TG，TC and supernatant TG with glucolipid-lipid metabolism disorders

2.5 玛咖复合黄精和桔梗对细胞内ROS 的影响

由图4 可知，与模型组相比，高质量浓度的玛咖和中、高质量浓度的黄精-桔梗混合物在单独作用时，均可不同程度降低胞内荧光值。除了低质量浓度的玛咖和低质量浓度黄精-桔梗混合物复配时对胞内荧光值无显著影响外，其他复配组合均能够显著降低胞内荧光值（P＜0.05）。当高质量浓度的玛咖和黄精-桔梗混合物复配时，胞内荧光值降低最显著（P＜0.05），约为25%，也即高质量浓度的玛咖和黄精-桔梗混合物复配时与阳性对照二甲双胍具有相当的清除ROS 的能力[16]。

由以上结果可知，玛咖与黄精-桔梗混合物分别以高质量浓度进行复配时，能够显著促进细胞糖吸收和糖原的合成和胞内TG 的合成和排出，同时降低细胞内TC 含量和ROS 水平。此外，质量浓度分别为1 mg/mL 的玛咖与黄精-桔梗混合物复配时调节糖脂代谢的效果最为显著。

3 结语

本实验得到玛咖水提物的得率为30.3%，黄精水提物的得率为46.0%，桔梗水提物的得率为40.9%。玛咖和黄精-桔梗混合物分别单独作用时，对细胞生长无明显影响的最大作用质量浓度为1 mg/mL（P＞0.05）。玛咖和黄精-桔梗混合物体积比1∶1 复配后，对细胞生长无明显影响的最大作用质量浓度为2 mg/mL（P＞0.05）。玛咖和黄精-桔梗混合物分别以质量浓度1 mg/mL 复配时，能够显著促进糖吸收和细胞内糖原的合成，同时降低细胞内TC含量和ROS 水平。因此，高质量浓度的玛咖和黄精-桔梗混合物复配可显著调节HepG2 模型细胞的糖脂代谢紊乱（P＜0.05）。

综上所述，玛咖、黄精和桔梗三者复配后能够更有效地通过促进糖吸收和细胞内糖原合成，降低细胞内胆固醇和ROS 水平，最终达到调节糖脂代谢的效果。本文中提供了一种安全且无副作用的具有改善糖脂代谢紊乱的玛咖和黄精-桔梗混合物复方，为玛咖功能组方的研发提供理论参考，也可为糖尿病等慢性疾病患者饮食提供更多选择。