Fe3O4-COOH 纳米材料对大肠杆菌菌株水平的指纹峰确定

黄艳玲， 程 杨， 李春媛

（1. 天津现代职业技术学院 生物工程学院，天津300350；2. 天津市食品研究所有限公司，天津301609；3. 国家农产品保鲜工程技术研究中心（天津） 农业部农产品贮藏保鲜重点实验室，天津300384）

利用MALDI-TOF MS 对微生物进行鉴别已成为当前的研究热点， 其中数据库鉴别法是MALDITOF MS 微生物鉴别的最常用的方法。 数据库鉴别法就是利用微生物建立标准质谱谱图数据库，将未知菌的质谱谱图与之比对， 通过指纹峰的比对，且超过一定阈值，从而确定微生物的归属[1-7]。

在数据库鉴别法中，微生物的指纹峰或蛋白标志物的确定非常重要， 通常由于质谱条件限制，一般MALDI-TOF MS 对微生物鉴别只能达到属和种的水平[8-9]。 利用数据库鉴别法对于菌株水平的微生物鉴别目前还不成熟，主要是其表型与基因型非常相似，导致质谱谱图几乎一致，很难找到足够多的指纹峰对微生物进行鉴别。 因此，发现更多的微生物指纹峰是目前利用MALDI-TOF MS 对微生物鉴别工作的一大挑战[10-13]。

为了解决这一问题， 作者利用Fe3O4-COOH 纳米材料对微生物裂解液中的蛋白质进行富集，以提高MALDI-TOF MS 对蛋白质检测的灵敏性与分辨率，通过增加质谱中蛋白质检出的数量，以提高微生物指纹峰的数量，从而增加微生物鉴别效果[14]。作者通过Fe3O4-COOH 纳米材料对大肠杆菌K-12 和大肠杆菌O127：H6 裂解液中蛋白质的富集，达到对其进行鉴别的目的。

1 材料与方法

1.1 仪器

本文中所涉及的实验仪器主要用于对大肠杆菌的破壁与蛋白质质谱检测（见表1），其中恒温水浴摇床对大肠杆菌进行培养，超声波细胞破碎仪用于对大肠杆菌进行细胞裂解得到细菌裂解液，而MALDI-TOF MS 则用于完成对细菌裂解液中蛋白质的检测。

表1 主要实验仪器设备Table 1 Experiment apparatus and equipments

1.2 材料

本实验中用于MALDI-TOF MS 分析的材料均为色谱纯（见表2）。

1.3 实验方法

1.3.1 大肠杆菌的培养 利用TSB 细菌培养基对大肠杆菌进行培养，培养条件：温度37 ℃，摇床转速120 r/min，培养16 h 后，取1 mL 发酵液10 000 r/min 离心6 min，用超纯水清洗3 次后，依次10 倍稀释，并进行平板计数。

1.3.2 大肠杆菌超声裂解 用离心管取5 mL 大肠杆菌稀释液，其中含有体积分数0.1%的TFA，在冰浴下，超声裂解3 min，细胞超声裂解仪开3 s 关3 s。

1.3.3 菌体蛋白富集与MALDI-TOF MS 检测 把合成完毕的Fe3O4-COOH 纳米材料溶解于20 mmol/L的醋酸钠溶液中， 最后定容Fe3O4-COOH 悬浊液至质量浓度为10 mg/mL。 取100 μL Fe3O4-COOH 悬浊液加入到E. coli裂解液中， 振荡30 min 充分吸附后， 磁性分离， 再用10 μL 磷酸缓冲液与10 μL乙腈洗脱10 min， 吸取1 μL 洗脱液与1 μL CHCA用于MALDI-TOF MS 分析。

MALDI-TOF MS 线性阳离子模式参数：离子源1：20 kV； 离子源2：17.8 kV；lens：6.00 kV；pulsed ion extraction：200 ns；matrix suppression：1 500；质谱范围m/z2 000～20 000 amu。

1.3.4 细菌蛋白质数据库检索 大肠杆菌的MALDI-TOF MS 质谱峰利用Tagident 蛋白质分析软件，检索蛋白质数据库，以确定各个质谱峰的蛋白质归属。

表2 试验药品Table 2 Experimental reagents

2 结果与讨论

2.1 富集前E. coil 菌株水平的鉴别

培养完毕的大肠杆菌，经过1∶10 梯度稀释得到细菌浓度为3×105CFU/mL 细胞悬浊液， 再利用细胞破碎仪对菌悬液进行破壁，得到大肠杆菌的细胞裂解液，然后分成2 份，一份为对照，另一份进行富集，加入100 μL Fe3O4-COOH 悬浊液到大肠杆菌裂解液中，震荡30 min 充分吸附后，磁性分离，然后用10 μL 磷酸缓冲液与10 μL 乙腈洗脱，吸取1 μL 洗脱液与1 μL CHCA 用于MALDI-TOF MS 分析。

图1 为Fe3O4-COOH 纳米颗粒富集前2 个大肠杆菌菌株 （K-12 和DSM 30083T）MALDI-TOF MS质谱图， 可以看出， 在m/z2 000～12 000 的质谱范围， 其质谱图在峰形上基本一致， 这主要是因为2个同属同种大肠杆菌在表型上基本一致，而且大多数峰位置也基本相同，但相对峰的强弱不同，唯一不同的质谱峰为大肠杆菌K-12 的m/z3 831（在图1（a）用星号标注的质谱峰），因此，未富集的细胞裂解液直接用MALDI-TOF MS 分析，很难获得更多的指纹峰用于细菌菌株水平的鉴别。

图1 富集前大肠杆菌不同菌株的鉴别Fig. 1 Identification of different strains of Escherichia coli before enrichment

2.2 富集后E. coil 菌株水平的鉴别

图2 为Fe3O4-COOH 纳米颗粒富集大肠杆菌K-12 和大肠杆菌DSM 30083T 裂解液的MALDITOF MS 质谱图。 可以看出，经过富集，质谱图的峰形有很大的改变，这主要是因为很多低丰度的蛋白质经过富集后，可以被MALDI-TOF MS 检测，而且质谱图的信噪比也大大提高。 富集前，质谱图信噪比大于3 的质谱峰共28 个， 其可能的指纹峰仅仅只有1 个（见图1）；富集后，MALDI-TOF MS 检测的分辨率和灵敏性大大增加， 质谱峰的数量达到110个左右， 其中大肠杆菌K-12 有16 个可能的指纹峰， 而大肠杆菌DSM 30083T 有21 个可能的指纹峰，文献上用MALDI-TOF MS 常规方法对大肠杆菌不同菌株进行检测，其可能的指纹峰最多能达到14个。 因此， 通过使用Fe3O4-COOH 纳米颗粒可以使MALDI-TOF MS 检测获得更多可能的指纹峰。

图2 富集后大肠杆菌不同菌株的鉴别Fig. 2 Identification of different strains of Escherichia coli after enrichment

为了验证MALDI-TOF MS 检测到的可能的指纹峰为大肠杆菌的蛋白质质谱信号， 检索UniProtKB/Swiss-Prot 和UniProtKB/TrEMBL 的蛋白质数据库， 获得匹配的质谱信号的蛋白质归属，其检索结果列在表3， 其中大肠杆菌K-12 有4 个匹配的指纹峰，这些指纹峰没有出现在大肠杆菌DSM 30083T 的谱图上， 而大肠杆菌DSM 30083T 获得9个指纹峰， 这些指纹峰没有出现在大肠杆菌K-12的质谱图上，这些质谱峰通过局部放大，标注在图3上，因此，通过以上实验表明，通过Fe3O4-COOH 纳米颗粒对大肠杆菌细胞裂解液的富集，不仅可以增加MALDI-TOF MS 检测的分辨率和灵敏性，而且可以大大增加大肠杆菌菌株水平的指纹峰数量。

3 结 语

作者利用Fe3O4-COOH 纳米颗粒对大肠杆菌K-12 和大肠杆菌DSM 30083T 裂解液中的菌体蛋白进行富集，不仅可以增加MALDI-TOF MS 检测的分辨率和灵敏性，而且可以大大增加大肠杆菌菌株水平的指纹峰数量，从而提高MALDI-TOF MS 对大肠杆菌菌株水平的鉴别。 因此Fe3O4-COOH 纳米颗粒富集菌体蛋白的方法有可能推广应用于致病菌菌株水平鉴别。

表3 大肠杆菌K-12 和DSM 30083T 蛋白标志物数据库搜索结果Table 3 Database search results of Escherichia coli K-12 and DSM 30083T protein markers

图3 利用Fe3O4-COOH 纳米颗粒富集的大肠杆菌K-12 和DSM 30083T 蛋白生物标志物MALDI 局部质谱图Fig. 3 Partial mass spectra of Escherichia coli K-12 and DSM 30083T protein biomarkers enriched by Fe3O4-COOH particles