高生理活性黑蒜加工工艺优化及功能成分变化

史润东东， 杨 成， 余佳浩， 张 建， 张连富*，，3

（1. 江南大学 食品学院，江苏 无锡214122；2. 石河子大学 食品学院，新疆 石河子832003；3. 北京工商大学 食品营养与人类健康北京高精尖创新中心，北京100048）

黑蒜是将鲜蒜置于高温高湿条件下经60～120 d的美拉德反应制得的天然大蒜产品。 口感酸甜软糯，无蒜辛辣味道，加工中显著增加的美拉德反应产物、有机硫化物、多酚、黄酮类物质等多种成分的共同作用促使黑蒜的功效显著强于鲜蒜[1-2]。 其中Amadori 化合物作为美拉德反应初期生成的一类稳定的极性分子，对形成果蔬制品独特的香气、味道有重要影响，不仅能够反映美拉德反应的进程，还具有多种生物活性，比如Ryu 等[3]研究表明黑蒜提取物中的1-脱氧-1-L-精氨酸-D-果糖 （Fru-Arg）具有抗氧化作用。 番茄产品中的1-脱氧-1-L-组氨酸-D-果糖（Fru-His）被证明具有抗肿瘤和抑制血管紧张素转换酶活性的作用[4]，可作为一类新型的潜在抗氧化剂。 因此Amadori 化合物可作为黑蒜品质的重要表征因子。 Yuan 等[5]研究表明黑蒜中3 种Amadori 化合物和3 种Heyns 化合物的含量比鲜蒜提高40～100 倍。 但反应进行到后期会产生诸如5-HMF、丙烯酰胺等多种有害成分。 除了加工中新生成的有益成分，鲜蒜本身还含有许多内源性生物活性物质如S-烯丙基半胱氨酸衍生物、烯丙基硫化物、硫代亚磺酸酯类等，具有降血压、提高免疫力、抗癌等健康益处[6]。 其中蒜氨酸作为大蒜特有的成分，是大蒜素的前体，具有较高的稳定性和多种功效，包括抗菌和降血糖等[7]。另外S-烯丙基半胱氨酸（SAC）在黑蒜中的含量可提高5～6 倍，具有降胆固醇、抗糖尿病、神经保护等作用，是黑蒜的有机硫化物中主要的活性成分之一[8]。

目前由于无标准的质量评价体系，市场上的黑蒜质量良莠不齐，且过长的加工时间使生产效率大大降低，成本较高。 在品质评价上，现有研究主要关注黑蒜中还原糖、氨基酸、总酸、多酚、黄酮等营养成分变化[9]。 在缩短加工时间上，多集中在对大蒜预冷冻、短时预热、超声预处理等方面[10-11]。 美拉德反应作为影响黑蒜品质及形成速度的关键，会受到温度、水分活度、时间、pH 等多种因素的影响。 研究表明升高黑蒜的加工温度会加速5-HMF 的产生及褐变[12]。 但各因素对黑蒜中Amadori 化合物的影响仍不明确。 另外目前未见关于水分活度对黑蒜功能成分影响的报道。

通过探究初始水分活度、温度、时间对黑蒜中12 种Amadori 化合物、SAC、蒜氨酸的影响，确定了黑蒜加工中的关键控制点，以期缩短加工时间的同时，最大限度保留有益物质，减少美拉德后期有害物质生成，并与市售黑蒜在上述功能成分、5-HMF、丙烯酰胺、抗氧化能力及感官指标方面进行对比，为黑蒜的加工及评价提供工艺参数和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大蒜：市售（3 种市售黑蒜产地为山东金乡、江苏邳州、云南洱海，加工时间均为120 d）；蒜氨酸（纯度98%）： 购自上海爱必信生物科技有限公司；SAC（纯度98%）、5-羟甲基糠醛（纯度99%）、丙烯酰胺（纯度98%）：购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸、甲酸（均为分析纯）：购自国药集团化学试剂有限公司；Amadori 化合物：基于作者所在实验室已有研究基础自制[13]（其结构经红外光谱、三重四级杆质谱及核磁共振表征，纯度均大于98%）。 用于色谱分离的甲醇和乙腈为HPLC 级。 所有溶液用超纯水制备。

1.2 主要仪器与设备

LHS-50CL 型恒温恒湿箱：上海一恒科技有限公司产品；高效液相色谱仪（紫外检测器）、超高效液相色谱串联四级杆质谱联用仪：美国Waters 公司产品；高速冷冻离心机：湖南湘立科学仪器有限公司产品；电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械有限公司产品；CH-8853 水分活度仪： 瑞士Novasina公司产品；电子天平：上海梅特勒-托利多仪器商贸公司产品；SIZ（Ⅲ）循环水式多用真空泵：南京予凯仪器设备有限公司产品；KQ-100E 型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司产品；超纯水仪：美国密理博公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 初始水分活度 新鲜大蒜去皮，选取无损伤且大小一致的蒜瓣均匀分布在洁净纱布上，在90 ℃下进行热风干燥，以降低原料的初始水分活度。 结合预实验结果，在不同时间点取样，使原料初始水分活度分别为0.87、0.71、0.54、0.41、0.28，置于铝箔袋中真空密封，以固定原料水分活度。 将样品放入恒温恒湿箱80 ℃反应2 d[14]。测定12 种Amadori 化合物、SAC、蒜氨酸的质量分数，以干质量计，确定最佳初始水分活度。

1.3.2 加工温度 90 ℃下将原料预烘到初始水分活度0.87，在湿度80%，温度分别为40、50、60、70、80 ℃，反应2 d。 测定上述功能成分含量，以干质量计，确定最佳加工温度。

1.3.3 加工时间 在原料初始水分活度0.87、湿度80%、温度70 ℃条件下，取样时间分别为8、10、12、14、16 d，测定上述功能成分含量，以干质量计，确定最佳加工时间。

1.3.4 样品制备 黑蒜提取液的制备参考Bae 等[15]的方法并作适当修改。准确称取3 g 样品，将样品密封后在80 ℃下水浴15 min 灭酶。 加60 mL 超纯水破碎打浆。 混合物超声（500 W）提取20 min，离心（10 000 r/min，10 min）取上清液。 残渣洗涤3 次并分别离心取上清液， 将上清液混合定容至100 mL。适当稀释后过0.22 μm 膜检测。

1.3.5 蒜氨酸和SAC 的HPLC 分析 蒜氨酸和SAC 的质量分数测定根据Kim 等[16]的方法进行略微改动。 液相条件： 色谱柱X select HSS T3 柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱温30 ℃；体积流量1 mL/min；进样量20 μL；检测波长208 nm。 流动相：A 是体积分数0.1%的磷酸水，B 是甲醇。 溶剂梯度如下：0～1 min，98%～95%A；1～3 min，95%～90%A；3～8 min，90%～85%A；8 ～10 min，85%A；10 ～15 min，85%～98%A；15～20 min，98%A。

1.3.6 美拉德产物的HPLC-MS 分析 美拉德产物的质谱条件：数据以多反映检测扫描（MRM）方式收集；ESI+模式；源模块温度120 ℃；去溶剂温度400 ℃；干燥气体N2（体积分数＞99.99%）；脱溶剂气体体积流量600 L/h；毛细管电压3.0 kV；检测器电压1 800 V，扫描范围m/z100～1 500，目标化合物的液质参数见表1。

表1 美拉德产物的液质参数Table 1 HPLC-MS parameters of Maillard products

色谱条件：检测采用ACQUITY HSS T3 色谱柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm），12 种Amadori 化合物的测定参照余佳浩等[13]的文献进行轻微调整。柱温35 ℃；体积流量0.3 mL/min；进样量1.0 μL；流动相：A 是体积分数0.1%的甲酸水，B 是乙腈；溶剂梯度如下：0～1 min，100%A；1～5 min，100%～90%A；5～6 min，90%～50%A；6～7 min，50%～20%A；7～9 min，20%A；9～9.5 min，20%～100%A；9.5～13 min，100%A。丙烯酰胺的检测参考国标[17]：柱温30 ℃；体积流量0.2 mL/min；进样量1.0 μL；流动相：A 是乙腈，B 是体积分数0.1%的甲酸水； 溶剂梯度如下：0～4 min，100%B；4～6 min，100%～85%B；6～8 min，85%～0%B；8～10 min，0%B；10～10.5 min，0%～100%B。 5-HMF的检测：柱温35 ℃；体积流量0.2 mL/min；进样量1 μL；流动相：体积分数0.1%甲酸水∶乙腈=86∶14（体积比）。

1.3.7 水分质量分数测定 按GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》[18]中直接干燥法测定。

1.3.8 水分活度的测定 测定参考GB 5009.238—2016 《食品水分活度的测定》[19]中水分活度仪扩散法，取适量蒜瓣切碎均匀放置在水分活度仪测量池内进行测定，平行3 次。

1.3.9 抗氧化活性的测定

1）DPPH 自由基清除能力的测定[20]：将25 μL黑蒜水提物与200 μL DPPH 溶液 （350 μmol/L）在96 孔板中混合， 室温避光反应4 h 后于517 nm 处测定吸光值， 按下式计算DPPH 自由基清除率，用甲醇做参比。 实验重复3 次。

式中，Ai为样品组吸光值；Aj为空白样品吸光值；A1为对照组吸光值；A0为空白组吸光值。

2）Fe2+还原能力的测定（FRAP）[21]：将300 mmol/L醋酸盐缓冲液、10 mmol/L TPTZ 溶液和20 mmol/L FeCl3溶液以体积比10∶1∶1 混合得到FRAP 试剂，10 μL 样品与300 μL FRAP 试剂混合均匀，室温反应30 min 测定593 nm 处吸光值， 抗坏血酸作阳性对照。以抗坏血酸当量和A593做标准曲线，计算黑蒜水提物的Fe2+还原能力， 结果以抗坏血酸当量（AAE）表示，单位：μmol/g。 实验重复3 次。

1.3.10 感官评定 参阅文献[22]制定黑蒜感官评分标准，选取10 名专业人士从口感、外观、组织状态、气味评分，评定前进行多次黑蒜品质特性描述的认定及培训，测定结果以平均值计，评价标准见表2。

表2 黑蒜感官评定标准Table 2 Standards of sensory quality of black garlic

1.3.11 统计分析 实验平行3 次，结果以平均值±S 表示， 数据采用One-way ANOVA 进行显著性分析，当P＜0.05 认为差异显著。 使用Graph Pad 5.0、Origin Pro 6 软件进行数据处理。

2 结果与讨论

2.1 热风干燥中功能成分质量分数随水分活度的变化

图1 分别显示了大蒜在热风干燥过程中Amadori 化合物、SAC、 蒜氨酸随水分活度的变化情况。随着水分活度的降低，蒜氨酸从质量分数54.81 mg/g 降低到0.95 mg/g，SAC 质量分数轻微增加，Amadori 化合物质量分数在水分活度0.87 到0.54时从282.44 μg/g 显著上升到583.13 μg/g（P＜0.05），之后则下降。 结果表明，水分活度的适当降低可能更有利于大蒜中Amadori 化合物的生成。 因此作者进一步探究了黑蒜加工中水分活度对上述功能成分的影响。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 黑蒜初始水分活度对功能成分的影响 水分活度作为影响美拉德反应速率的一个重要因素，过高或过低时均不利于反应发生。 另一方面，水分活度的高低与黑蒜的软硬质地密切相关。由图2（a）可知， 总Amadori 化合物的质量分数随初始水分活度的降低呈现先上升后下降的变化，当黑蒜初始水分活度为0.71 时，总Amadori 化合物的质量分数达到最大值 （1 348.67 μg/g）。 除了Fru-Met、Fru-Thr随水分活度的降低而降低， 其余Amadori 化合物与总Amadori 化合物质量分数的变化趋势一致。 这可能是由于葡萄糖与氨基酸通过羰氨缩合脱去一分子水，经Amadori 重排生成美拉德反应初期产物时，是一个可逆的反应[23]。当大蒜的水分活度过高时，反应向逆方向进行， 但当大蒜的水分活度过低时，由于缺少水作为传递介质， 底物的可移动性降低，接触几率减小，造成美拉德反应速度缓慢。 通过热风干燥将大蒜的初始水分活度迅速降低到合适范围，利于促使美拉德反应发生， 缩短黑蒜的加工时间。从图2（b）（c）可知，随着水分活度的降低，SAC 的质量分数稳中有降，由8.58 mg/g 降到5.91 mg/g，质量分数发生下降可能由于SAC 在更长时间的受热下参与了美拉德反应。 蒜氨酸在水分活度0.87～0.71时急剧降低，之后趋于平缓。Amadori 化合物在初始水分活度0.71 时达到最大，但当水分活度0.87 时，3 类功能成分总质量分数最高，综合考虑，确定初始水分活度0.87 为适宜加工条件。

图1 热风干燥时蒜中Amadori 化合物、SAC、 蒜氨酸质量分数随水分活度的变化Fig. 1 Contentsof Amadori compounds，SAC and alliin in garlic changed with water activity during hot-air drying

图2 水分活度对黑蒜中Amadori 化合物、SAC、 蒜氨酸质量分数的影响Fig. 2 Effect of water activity on the content of Amadori compounds，SAC and alliin in black garlic

2.2.2 温度对功能成分的影响 由图3（a）可知，温度从40 ℃升到70 ℃时，总Amadori 化合物的质量分数缓慢增加，12 种Amadori 化合物的质量分数表现出不同程度的上升。当温度80 ℃时，总Amadori 化合物质量分数显著上升，且12 种Amadori 化合物质量分数均达到最大值。 这可能因为温度的升高使黑蒜中葡萄糖与氨基酸的反应活性得到增强；另外分子的运动加快，使反应底物接触的速度提升。由图3（b）可知，随着温度的升高，SAC 的质量分数逐渐由4.72 mg/g 增加到6.92 mg/g，而蒜氨酸的质量分数呈现递减的趋势，由21.38 mg/g 减少到2.21 mg/g（见图3（c））。 由于大蒜预先经过90 ℃的热风干燥，内部各种酶基本失活，因此通过酶促反应造成蒜氨酸减少的可能性很低， 其损失更可能归因于热降解。蒜氨酸中的亚砜键具有不稳定性， 当进行热处理时，蒜氨酸可以转化为SAC、烯丙基丙氨酸硫化物及二嘌呤硫化物等[24]。 而蒜氨酸的热降解或谷氨酰半胱氨酸的分解代谢则可能是SAC 质量分数增多的原因。80 ℃下Amadori 化合物和SAC 质量分数最高，但由于美拉德反应速率过快，最终的黑蒜有明显苦味，品质不佳，故选择70 ℃作为加工温度。

图3 温度对黑蒜中Amadori 化合物、SAC、 蒜氨酸质量分数的影响Fig. 3 Effect of temperature on the content of Amadori compounds，SAC and alliin in black garlic

2.2.3 时间对功能成分的影响 图4（a）表明随着加工时间的延长， 总Amadori 化合物的质量分数先升高后降低，在第14 天达到最大值5 510.55 μg/g，其中Fru-Arg 为主要的美拉德产物， 占比高达76%。 总质量分数相比第8 天的2 682.82 μg/g 增加了105%，第16 天则减少到3 845.84 μg/g。 美拉德反应是一个动态平衡的过程，反应前期羰基化合物（主要为还原糖）和氨基化合物（氨基酸和蛋白质）较为充足，Amadori 化合物的生成速率大于分解速率，因此作为反应产物不断积累；后面Amadori 化合物作为反应底物参与美拉德后期反应，加之还原糖和氨基酸的消耗， 使其生成速率小于分解速率，造成含量下降。 SAC 随时间的变化如图4（b）所示，从8～16 d 其质量分数由5.10 mg/g 降到2.35 mg/g，质量分数降低了54%。 蒜氨酸的质量分数在8～10 d从2.73 mg/g 略微下降到2.11 mg/g， 之后则基本稳定在2.0 mg/g（见图4（c））。事实上，蒜氨酸质量分数的显著降低主要发生在最初的2 d，Zhang 等[25]发现黑蒜加工过程中蒜氨酸的质量分数在最初的2 d 从11.28 g/kg 减少到3.87 g/kg，4～7 d 质量分数稳定在1.3 g/kg。 蒜氨酸和SAC 质量分数降低可能与其参与美拉德反应有关[26]，研究证明蒜氨酸和葡萄糖间可以发生美拉德反应，主要的反应产物是吡嗪和噻唑[27]。 Wakamatsu 等[28]将SAC 和葡萄糖在低水分、100 ℃条件下加热，并分离鉴定出9 种美拉德反应产物。 14 d 时功能成分总质量分数及Amadori 化合物质量分数均最高，且黑蒜具备酸甜口感，与12 d和16 d 感官品质相似，故最终选择加工时间为14 d。

图4 时间对黑蒜中Amadori 化合物、SAC、 蒜氨酸质量分数的影响Fig. 4 Effect of time on the content of Amadori compounds，SAC and alliin in black garlic

2.3 自制黑蒜与市售黑蒜成分对比

为探究自制黑蒜与市售品间的差异，图5 对比了自制黑蒜与3 种市售黑蒜中上述功能成分及2种美拉德后期有害产物（5-HMF、丙烯酰胺）的含量。 自制黑蒜中的Amadori 化合物和SAC 的质量分数均明显高于其他3 种市售黑蒜。 3 种市售黑蒜的Amadori 化合物质量分数相近，分别为山东金乡4 581.44 μg/g、江苏邳州3 656.78 μg/g、云南洱海3 893.99 μg/g。 而SAC 质量分数差异较大，分别为自制黑蒜2 946.52 μg/g、 江苏邳州1 222.64 μg/g、云南洱海409.47 μg/g， 山东金乡黑蒜中未检测到SAC。另外自制黑蒜的5-HMF 和丙烯酰胺的质量分数低于其他黑蒜产品。 尽管自制黑蒜中的蒜氨酸质量分数（1 879.94 μg/g）低于山东金乡和江苏邳州的黑蒜（分别为4 773.36、3 850.60 μg/g），但高于云南洱海的黑蒜（1 418.22 μg/g）。整体来看，自制黑蒜的功能成分总质量分数高于3 种市售黑蒜，美拉德有害产物总质量分数低于3 种市售黑蒜。 这可能是由于市售黑蒜加工时间较长，导致美拉德后期反应的程度较高。 于蒙娜等[29]监测到黑蒜反应20 d 期间5-HMF 一直呈增加趋势，0～8 d 5-HMF 质量分数几乎为0，10～20 d 其质量分数由2 kg/g 增长到8 kg/g。而赵雪晴等[11]结合预冷冻处理使黑蒜周期缩短4 d，5-HMF 含量显著减少。表明长时间的加工会导致后期有害物增多，也标志着美拉德反应程度的加深。 因此缩短加工时间利于减少美拉德后期有害物的积累。

图5 不同黑蒜中成分对比Fig.5 Comparison of componentsin different black garlics

2.4 抗氧化活性对比

由图6 可知自制黑蒜的DPPH 自由基清除率（86.82%）略高于山东金乡的黑蒜（83.17%），两者比江苏邳州和云南洱海的黑蒜高约1.3 倍； 自制黑蒜的Fe2+还原能力最强，为109.75 μmol/g，比江苏邳州和云南洱海的黑蒜（分别为66.83、54.37 μmol/g）高1.6 和2 倍，略高于山东金乡的黑蒜（101.38 μmol/g），这可能是由于自制黑蒜中较高的Amadori 化合物和SAC 促进了抗氧化能力的提高。

2.5 感官评价

4 种黑蒜的感官评价结果见表3， 云南洱海生产的黑蒜评分最好，其次是自制黑蒜，再次是山东金乡和江苏邳州产的黑蒜，各产品间评分差异不显著。 从评分来看，自制黑蒜在感官品质上与市售黑蒜相近。

图6 不同黑蒜产品的DPPH 和FRAP 抗氧化活性Fig. 6 Antioxidant activities of DPPH and FRAP in different black garlic products

表3 4 种黑蒜的感官评价Table 3 Sensory evaluation of 4 kinds of black garlic

3 结 语

以黑蒜中12 种Amadori 化合物、SAC 和蒜氨酸为指标，从调控美拉德反应角度出发，探究初始水分活度、温度、时间对黑蒜功能成分及品质的影响，确定了最优工艺：初始水分活度0.87、加工温度70 ℃、加工时间14 d。在此工艺下，自制黑蒜中上述功能成分总质量分数最高， 为10 337.01 μg/g，5-HMF 和丙烯酰胺总质量分数最低，为1 326.81 μg/g。DPPH 自由基清除能力和Fe2+还原能力强于3 种市售黑蒜，Amadori 化合物的增多为黑蒜抗氧化性的提升起到促进作用。 本工艺研制的自制黑蒜的感官评分与市售黑蒜相当， 加工时间显著缩短88%，对于提升黑蒜品质及生产效率具有指导意义。