复方熊胆滴眼液治疗急性细菌性结膜炎作用及其机制的网络药理学分析

王珊珊黄楚龙黎芳刘巧明林忆龙方雪湾梁健钦

（1.中山大学中山眼科中心药学部，广东 广州510060； 2.广西中医药大学药学院，广西 南宁530200）

结膜炎是一种发生在结膜上的炎症疾病，临床上常见的有急性细菌性结膜炎和流行性角结膜炎，发病急是该病特点，伴以流泪畏光、结膜充血发红，俗称红眼病［1-2］。 中医认为该病由肝肺内热，内热壅盛上犯于目，与复感外邪（以风热为主）所致［3］。 复方熊胆滴眼液是2015 年版《中国药典》收载品种，由熊胆粉、天然冰片组成，方中熊胆粉平肝明目、退热清火，冰片能通诸药、散郁火、去翳明目［4］。 我院（中山大学中山眼科中心）收集多例急性细菌性结膜炎患者，通过研究表明复方熊胆滴眼液用于临床治疗急性细菌性结膜炎疗效确切，但作用机制未明确。 网络药理学是以现代医药学数据库为基础，依靠网络方法构建“药物-基因-靶点蛋白-疾病”网络图，能系统分析中药复方对生物网络的相互作用，具有整体性、系统性的特点［5］，是目前研究中药复方作用机制的有效手段。 因此，本文采用网络药理学的方法，尝试从整体、系统的角度分析复方熊胆滴眼液治疗急性细菌性结膜炎的作用机制，为研究该中成药的临床应用提供依据。

1 软件及数据库

TCMSP （http：／ ／lsp. nwu. edu. cn／tcmsp. php）、DRAR-CPI（http：／ ／cpi.bio-x.cn／drar／）、ChemSpider数据 库（http：／ ／www. chemspider. com／）、PubChem Compound 数 据 库（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）、TTD 数据库（http：／ ／bidd.nus.edu.sg／group／cjttd／）、Drugbank 数 据 库（version 5.1.1，https：／ ／www.drugbank.ca／）、UniProt 数据库（https：／ ／www.uniprot.org／）、String 数据库（version 10.5，https：／ ／string-db.org／）、Cytoscape（version 3.7.1）。

2 方法与结果

2.1 临床疗效观察

2.1.1 一般资料随机选取中山大学中山眼科中心2018 年2 月—2018 年12 月就诊的急性细菌性结膜炎患者80 例，随机均分为对照组及观察组，对照组患者为21 例女性与19 例男性，年龄18 ～40 岁，平均（29.73±4.45）岁，观察组患者为22 例女性与18例男性，年龄20 ～41 岁，平均（31.73±3.87）岁。两组患者一般资料差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

2.1.2 纳入标准对照组及观察组均接受眼部炎症反应检查排除其他眼部疾病，患者有畏光、流泪、目赤肿痛、黏脓性分泌物等，符合诊断要求［6］。

2.1.3 治疗方法对照组给予左氧氟沙星滴眼液（河北创健药业有限公司），滴入眼睑内，滴药3 次／d，2 滴／次；观察组给予复方熊胆滴眼液（长春普华制药股份有限公司），滴入眼睑内，滴药6 次／d，2 滴／次。 均连续用药3 d。

2.1.4 观察指标观察两组患者治疗后的临床疗效，疗效评价标准［7］：治愈，患者用药后临床症状及体征消失；显效，患者用药后临床症状及体征明显改善；有效，患者用药后临床症状及体征好转；无效，患者用药后临床症状及体征无变化；总有效率＝（治愈＋显效＋有效）／总例数×100%。

2.1.5 统计学分析选用SPSS 21.0 软件对数据进行秩和检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1.6 结果观察组有效率明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 作用机制的网络药理学分析

2.2.1 化合物筛选及其作用靶点预测通过中药系统药理学分析平台（TCMSP）检索冰片的化合物（化合物筛选标准：OB ≥30%、DL ≥0.18 或符合Lipinski 类药性五原则均纳入），共得到α-蒎烯、齐墩果酸、异龙脑等31 种化合物。 通过NCBI 数据库、ChemSpider 数据库检索［8-14］，得到熊胆粉中含有的牛磺熊去氧胆酸、牛磺去氧胆酸、熊去氧胆酸等11 个化合物。 然后，通过PubChem Compound 数据库检索，获得上述42 个化合物的3D 结构，并保存为SDF 格式文件，导入DRAR-CPI 数据库预测靶点，并以对接分数Z′-score＜-1.5（Z′-score＜-0.5 时化合物与靶点潜在结合的可能性，值越小的化合物和靶点的结合牢固）对靶点进行筛选，去除重复靶点，最终获得192 个化合物靶点，最后通过Uniprot 数据库以校正192 个化合物靶点的名称为官方名称。

2.2.2 疾病相关靶点的筛选、发病机制分析通过TTD 和Drugbank 数据库预测结膜炎的疾病靶点，关键 词 有 “ conjunctivitis ”， “ epidemic keratoconjunctivitis”，“acute bacterial conjunctivitis”，并以来源于人（Homo sapiens）为条件筛选疾病靶点，去除重复靶点后得到85 个结膜炎的疾病靶点，同法校正靶点名称。 将85 个靶点导入String 数据库，隐藏网络中无相互作用的靶点，进行蛋白互作分析，然后保存TSV 文件格式，最后导入Cytoscape 构建互作网络图（如图1）。 Degree 值越大则表示该靶点是疾病的关键靶点，与疾病密切相关，提示人们可寻找或开发该靶点的抑制剂，以达到缓解甚至治愈疾病的新药。 按Degree 值由大到小排序前35 个疾病靶点如下（括号内为该蛋白的Degree 值，下同）：IL6（43），TLR4（32），NFKB1（32），TLR2（30），ICAM1（30）， STAT3 （26）， RELA （25）， IKBKB （24），HSP90AA1（23），CHUK （22），MTOR （21），SYK（18），LYN（18），PRKCA（17），TBK1（15），HMGB1（15）， NFKB2 （14）， NOD2 （14）， CXCR4 （14），PRKCZ（13），PRKCB（12），IL12B（12），PRKCD（12），PRKCE（12），IL23A（11），LY96（11），PRKCQ（11），CD14（11），MUC1（11），CRP （11），ITIH4（10），RIPK2（9），HSPA8（9），IL6R（8），KRT5（8）。GO 和KEGG 分析显示，急性细菌性结膜炎的发病涉及免疫系统过程的调节、对细菌防御反应及对外部刺激、细菌来源分子反应等714 个生物过程，涉及病毒受体、信号传感、蛋白激酶等的活性和蛋白质结合、小分子结合等共38 个分子功能，并由囊泡、膜结合泡、胞外间隙、白细胞介素-6 受体复合物及免疫突触等47 个细胞成分条目参与。 该病与甲型流感、病毒感染、PI3K-Akt 信号通路、单纯疱疹病毒感染、炎症介质对色氨基酸通道调节作用及血管平滑肌收缩等104 条信号通路异常相关。

表1 两组患者治疗后的临床疗效Table 1 Clinical efficacy of the two groups after treatment ［n （%）］

图1 疾病靶点的网络PPI 图Figure 1 PPI map of disease target

2.2.3 化合物靶点及其作用机制分析将192 个化合物靶点与85 个疾病靶点，导入String 数据库，去除无相互作用的靶点，最后得到一个由215 个节点和1 945 条边组成的网络，平均节点度为18.1，网络密度为0.54。 选取combined score＞0.9 的边（edge，即蛋白的作用关系），共筛选出由36 个化合物作用靶点［分别是SRC（34），MAPK3（33），MAPK1（32），TP53（32），EGFR（31），PIK3R1（30），IL4（30），JUN（30），VEGFA（30），IL1B（29），TNF（29），JAK2（26），MAPK14（29），PIK3CG（28），MAPK8（28），HGF（27），HRAS（25），APP（25），PLG（24），CCL2（24），RHOA（23），VCAM1（22），LCK（21），JAK3（18）， SELE （16）， CHRM1 （12）， HTR2A （10），ADRA1B（9），GHR（9），CHRM3（9），BTK（9），ADRA1A（9），ADRA1D（8），CSF2RB（7），B4GALT1（2），B4GALT4（2）］和15 个疾病靶点［（分别是STAT3（29），ICAM1（26），SYK（20），IL6R（14），LGALS3（12），PTAFR（12），HRH1（10），TIMP3（9），KRT8（8）， LUM （7）， ORM2 （6）， ORM1 （6），MAPKAPK2（6），KRT5（4），MKL1（1）］组成的关键靶点集。 将上述51 个靶点组成的靶点集导入String数据库，得到一个由51 个节点、461 条边组成的网络，平均节点度为18.1，网络密度为0.801，网络密度增加，说明该网络较之前的大网络（网络密度为0.54）更重要。 对该网络进行GO、KEGG 富集分析，GO 分析结果显示，该复方熊胆滴眼液调控了包括转运、细胞迁移、白细胞迁移、细胞或亚细胞成分的运动、对有机氮化合物的反应、先天免疫反应、细胞定位、防御反应、对有机物的反应、细胞表面受体信号通路等789 个生物过程，以及影响蛋白质结合、G 蛋白偶联受体活性、受体结合、磷酸酶结合、非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性、信号传感器活动、酶结合、α1-肾上腺素能受体活性、MAP 激酶活性、磷酸酶结合等55 个分子功能。 KEGG 分析显示，51 个关键靶点主要富集的KEGG 通路如表2 所示，信号通路为按出错率（false discovery rate，FDR）由小到大排列，前10 位的通路见表2，提示复方熊胆滴眼液治疗结膜炎与调控Proteoglycans in cancer、TNF signaling pathway、Fc epsilon RI signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway 等多条信号通路有关。

2.2.4 “药材-化合物-作用靶点-信号通路”网络的构建将药材与其对应的化合物、化合物对应的靶点以及实验所筛选出的关键靶点导入Cytoscape 构建网络，结果见图2。 可见，复方熊胆滴眼液通过多靶点作用及多条信号通路的调节发挥治疗结膜炎的作用，其中熊胆粉化合物的靶点发挥了主要作用。

表2 复方熊胆滴眼液KEGG 富集分析结果Table 2 KEGG enrichment analysis of FuFang Xiongdan Diyanye

图2 药材-化合物-作用靶点-信号通路网络图Figure 2 Network diagram of drug-compound-target-signal pathway

3 讨论

3.1 复方熊胆滴眼液可能作用于STAT 3、ICAM1、HRH1 等靶点

前房炎症破坏了角膜内皮细胞的屏障功能，严重可导致视力丧失，是造成失明的主要原因之一。STAT 3（信号转导和转录激活因子3）信号的激活通过炎症调节细胞内的各种反应，介导屏障功能标志ZO-1 的表达。 磷酸化STAT3 水平会随着炎症发生时LIF、IL-6 和IFN-γ 等细胞因子水平的升高而升高，从而降低ZO-1 蛋白表达，进而降低跨内皮细胞电阻，并诱导细胞凋亡。 STAT 3 的转录激活直接调控ZO-1 启动子区，调节屏障功能，可见，STAT 3 能保护角膜内皮细胞对多种炎症因子的损害和对角膜内皮细胞环境稳态的重要性［15］。 STAT3 可增强NA组细胞增殖能力，对视网膜色素上皮细胞抗氧化应激有保护作用［16］。 本文研究发现，STAT3 靶点与结膜炎的病程密切相关，是该疾病的重要靶点，且“核心化合物靶点-核心疾病靶点”网络结果也显示复方熊胆滴眼液的化合物多个靶点（JAK2、SRC、EGFR、JAK3、LCK、CSF2RB、VEGFA、JUN、MAPK8）均直接作用于STAT3，提示复方熊胆滴眼液通过化合物靶点直接作用于STAT3 发挥治疗作用。

黏附分子1（ICAM1）是在细胞表面表达的一类能够介导细胞间或细胞与细胞外基质相互作用的糖蛋白，分布在活化的淋巴细胞、巨噬细胞、内皮细胞、各种上皮细胞及成纤维细胞的表面，可与多种细胞的表面成分结合，形成网络，参与细胞调控功能，在炎症、免疫反应及创伤修复等过程中发挥关键的作用。 ICAM1 与白细胞表面的淋巴细胞功能相关抗原-1 结合，并介导白细胞与血管内皮黏连及穿过血管内皮移行到炎症组织和创伤部位，促进炎症的发生与发展，从而导致免疫介导的视网膜组织的损伤［17］。 由本文的结果可推测，SELE、TNF、VCAM1等多个化合物靶点直接作用ICAM1 以减轻结膜炎的炎症反应。

组胺受体H1（HRH1）是发现最早的一类炎症介质，主要分布在肥大细胞及嗜碱性粒细胞中，介导平滑肌收缩、炎症反应和调节血管的收缩与通透性；末梢静脉收缩导致毛细血管通透性增加；参与过敏反应、胃酸分泌、血管调节等过程。 肥大细胞被活化后释放组胺进而促进眼眶成纤维细胞产生IL-6、IL-8 等炎症因子，间接影响炎症的发展［18］。 HRH1 可舒张血管，降低毛细血管的通透性，导致人体出现充血、水肿的症状；使人泪腺分泌增加出现流泪现象；还可刺激神经末梢诱发瘙痒感，目前被公认为引起瘙痒的介质［19］。 从上述组胺的功能作用发现，HRH1 引发的现象与结膜炎出现的症状均吻合，提示它与结膜炎的发生与发展密切相关。 通过本文结果分析，认为复方熊胆滴眼液可能是CHRM1、APP、PIK3R1、ADRA1D 等8 个化合物靶点作用于HRH1，从而缓解结膜炎引起充血、流泪、瘙痒等症状。

3.2 复方熊胆滴眼液可能参与调控PI3K-Akt、Influenza A 等多条信号通路

病毒感染后，在细胞内病毒蛋白合成和病毒附着而激活PI3K／Akt 信号通路，然后通过干扰促凋亡信号反应，维持细胞活力和增殖，进而激活下游转录因子，促进病毒复制，表明PI3K 支持病毒的进入和萌发等生命周期［20-21］。 SYK、JAK2 等化合物靶点介导Influenza A、PI3K／Akt 信号通路，参与细胞增殖和存活、血管生成、细胞因子调控、病毒蛋白表达、巨噬细胞趋化作用等生物功能，调控着IL-6、ICAM1等疾病因子的表达。 本文通过构建关键的化合物-疾病的靶点PPI 网络，并借助数据库进行GO、KEGG 富集分析，GO 功能富集分析结果提示关键靶点主要参与了多种细胞调控、白细胞迁移、增殖、凋亡等生物学过程和分子功能，KEGG 富集分析结果显示这些关键靶点主要富集到与炎症、疱疹病毒感染、流感以及肿瘤等与结膜炎相关通路上。

本文采用网络药理学方法对复方熊胆滴眼液及急性细菌性结膜炎的靶点进行预测，构建“化合物-靶点-信号通路”网络及蛋白互作分析，初步阐明了复方熊胆滴眼液治疗急性细菌性结膜炎的作用机制，进一步可以虚拟筛选有效成分及核心疾病靶点，从分子水平探讨复方熊胆滴眼液治疗结膜炎的作用机制。