基于纳米TiO2和金纳米星的光电化学适配体传感器检测Hg2+的研究

庄玉娇 巫仙群 王宇蕊 文 勉 罗贵铃 孙 伟 牛燕燕*

(海南师范大学化学与化工学院海口市功能材料与光电化学重点实验室海南海口 571158)

适配体(Aptamer)是经过指数富集配体系统进化的体外筛选技术而获得的，具有特异性结合能力的DNA或RNA片段，基于其单链核酸结构和空间构象多样性，能够与特定的靶分子通过假碱基对的氢键、堆积、静电作用等结合形成结构稳定的三维结构，具有极强的识别能力和亲和力[1-3]。光电化学生物分析技术是基于光照条件下，识别元件和目标分子间的生物识别作用引起的光电活性物质产生电信号变化的一种方法，可以实现待测物的定量检测。该方法的激发信号和检测信号的能量形式不同，传感信号的背景值低于传统电化学方法，因此具有较高的灵敏度和较低的检测限[4-6]。

Hg2+是一种常见的重金属污染物，多存在于土壤或者水体中且不能被降解，而且可以通过微生物的作用转变为剧毒的甲基汞，往往通过食物链富集并对人体健康产生极大危害，尤其对神经、肾脏等损伤较严重，可造成认知和行动障碍[7-10]。传统的Hg2+检测方法有原子吸收法、阳极溶出伏安法、等离子体质谱法等。虽然这些方法灵敏度高、特异性强，但是样品前处理复杂，仪器价格昂贵且运行成本高，难以满足快速实时检测的需求。一些快速在线的检测方法，如酶分析法、免疫分析法等，则无法对待检测物准确定量，灵敏度和准确性也比较低[11]。为实现简便快速的检测目的，越来越多的研究开始关注如何提高定量分析的灵敏度和准确性。

本文以半导体纳米TiO2为光电活性材料，以氧化铜锡(ITO)导电玻璃为基底电极，进一步修饰金纳米星，通过Au-S键的共价结合，将巯基修饰的特异性适配体固定在其表面，以巯基乙酸做封闭剂，经过实验参数的优化，构建了一个光电化学分析的适配体传感器，其光电化学反应原理如图1所示。该传感器用于检测Hg2+时，适配体中的T碱基与其形成稳定的“T-Hg2+-T”结构，导致传感界面发生变化[12，13]，使传感器特异性识别Hg2+前后光电流响应发生变化，从而实现Hg2+的快速定量分析。

图1 适配体传感器的制备及Hg2+检测过程示意图Fig.1 Illustration for aptamer sensor formation and Hg2+ detection process

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

PEAC 200A光电化学反应仪(天津艾达恒晟科技发展有限公司)，激发光波长为365 nm(LED光源)，偏置电压为0.2 V。光电化学测试在IGS1130电化学工作站(广州盈思仪器有限公司)上进行，采用三电极工作系统，以氧化铟锡(ITO，天津艾达恒晟科技发展有限公司)导电玻璃为基底电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝为对电极。电解液为0.1 mol/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH=7.0)。JSM-7600F热场发射扫描电子显微镜、JSM-2010F透射电子显微镜(日本，JEOL公司)。

纳米TiO2和Au纳米星购自南京先丰纳米材料科技有限公司。乙醇、丙酮、巯基乙酸(MPA)、磷酸盐等均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。As3+、Mn2+、Al3+等金属离子溶液均购自国家有色金属及电子材料分析测试中心。适配体(上海生工生物工程技术与服务有限公司)序列如下：5′-SH-(CH2)6-T T T T T T T T T T T-3′。适配体溶液由pH=7.0的PBS(0.01 mol/L)配制并保存于超低温冰箱中待用。实验过程中的用水由Milli-Q IQ7000超纯水仪(默克密理博)制备。

1.2 Hg2+光电化学适配体传感器的制备

ITO导电玻璃依次用丙酮、乙醇、水分别超声清洗30 min，晾干后备用。在洗净的ITO导电玻璃表面滴涂40 μL 2.0 mg/mL的纳米TiO2分散液，置于70 ℃烘箱中烘30 min，将其标记为TiO2/ITO。再滴涂20 μL Au纳米星分散液，室温避光自然晾干，标记为Au/TiO2/ITO。进一步，滴涂20 μL 1.0 μmol/L的巯基修饰适配体溶液，常温恒湿孵育2 h后，经0.01 mol/L PBS淋洗，再滴涂20 μL 0.1 mmol/L MPA，常温恒湿孵育1 h，封闭电极表面未被核酸适配体覆盖的空余位点，防止传感器表面非特异性吸附。最后用0.01 mol/L PBS淋洗，室温晾干后待用，标记为Aptamer/Au/TiO2/ITO。

图2 (A)纳米TiO2的扫描电镜(SEM)图；(B)金纳米星的透射电镜(TEM)图Fig.2 (A) SEM image of TiO2 nanoparticles;(B) TEM image of Au nanostars

2 结果与讨论

2.1 TiO2与Au纳米星的表征

采用扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)对纳米TiO2和Au纳米星的形貌进行表征，结果如图2所示。由图可见，纳米TiO2(图2A)粒子呈分布均匀的短棒状，平均粒径约为250 nm。相同放大倍数的Au纳米星(图2B)呈尖角状，平均粒径约为20～50 nm。说明纳米TiO2可以提供较大的比表面积并均匀负载Au纳米星。

2.2 实验条件的优化

为提高灵敏度，首先优化了实验条件。考察了不同浓度TiO2分散液(0.2～5.0 mg/mL)对TiO2/ITO修饰电极光电流响应的影响。如图3A所示，当分散液浓度小于2.0 mg/mL时，随着浓度的减小，光电流响应由于活性位点减少而减小；当分散液浓度等于2.0 mg/mL时，光电流响应达到最大；当分散液浓度大于2.0 mg/mL时，由于涂覆的TiO2层厚度增大，其本身的半导体性质反而阻碍了光生电子的传递，导致光电流响应逐渐减小。因此TiO2分散液最佳浓度为2.0 mg/mL。进一步考察了Au纳米星用量对Au/TiO2/ITO修饰电极光电流响应的影响，如图3B所示。当涂覆体积小于20 μL时，界面的光电性能随着Au纳米星负载量的增加而增强；当涂覆体积等于20 μL时，光电流达到最大；当涂覆体积大于20 μL时，过量的Au负载会覆盖光电活性位点，导致光电流逐渐下降，故Au纳米星最适宜的涂覆体积为20 μL。最后，考察了适配体的孵育浓度对Aptamer/Au/TiO2/ITO修饰电极光电性能的影响。如图3C所示，当适配体浓度为1.0 μmol/L时，光电流响应最大，随着适配体浓度逐渐增大，由于适配体本身的负电性，过量的适配体阻碍了电子的传递，光电流响应值逐渐减小。

图3 不同浓度TiO2(a→g：0.2,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mg/mL)分散液(A)、不同体积Au纳米星(a→g：5,10,15,20,25,30,35 μL)(B)和不同浓度适配体(a→f：0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 μmol/L)(C)对Aptamer/Au/TiO2/ITO光电流响应的影响Fig.3 Effects of TiO2 concentration(a→g:0.2,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mg/mL)(A)，Au volume(a→g:5,10,15,20,25,30,35 μL)(B) and aptamer concentration (a→f:0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 μmol/L)(C) on photocurrent

2.3 不同修饰电极的阻抗测定及分析

实验对不同修饰的电极在光辐照条件下的交流阻抗进行分析。如图4所示，ITO基底电极(曲线a)阻抗最大，阻抗值为40.0 Ω；当修饰TiO2纳米材料(TiO2/ITO，曲线b)后阻抗显著减小(24.9 Ω)。这是由于半导体材料在光辐照条件下产生光生电子，形成光电流，电阻减小；当修饰Au纳米星(Au/TiO2/ITO，曲线c)后，阻抗略有减小(22.7 Ω)，具有高导电性的纳米Au可以促进电子传递；当进一步孵育适配体(Aptamer/Au/TiO2/ITO，曲线d)后，阻抗增大(27.1 Ω)，修饰在电极表面带负电的适配体阻碍了电子的转移和传递。这与I-t曲线的表征结果是一致的，同时也说明每一步电极修饰的过程都是成功的。

2.4 Hg2+的检测

当传感界面(Aptamer/Au/TiO2/ITO)未结合Hg2+时，半导体纳米TiO2吸收辐射光能，电子从价带跃迁至导带并流向外电路，而价带的空穴接受界面电子供体的电子，形成光电流。当Hg2+与传感界面的适配体特异性结合(Hg2+/Aptamer/Au/TiO2/ITO)时，界面结构会发生改变，导致光生电子传递路径发生变化，光电流响应信号也随之改变，这种变化趋势与Hg2+浓度呈一定的函数关系。如图5所示，随着Hg2+浓度的增大，光电流响应信号逐渐减弱[14，15]，适配体富碱基T序列与Hg2+结合形成折叠的发卡结构，光生电子受Hg2+吸电子作用而流向汞，因此Hg2+在一定浓度范围内，光电流响应随着Hg2+浓度的增大而减小。实验结果表明，当Hg2+浓度在1.0×10-9～5.0×10-7mol/L范围时，光电流响应信号与Hg2+浓度呈较好的线性关系，线性方程为:I=-0.317logcHg2+-1.276，相关系数R2=99.7，检测限(信噪比S/N=3)为3.1×10-10mol/L。

图4 不同修饰电极的阻抗图Fig.4 Electrochemical impedance spectroscopy of different modified electrodesa:ITO,b:TiO2/ITO,c:Au/TiO2/ITO,d:Aptamer/Au/TiO2/ITO) in the presence of 10.0 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4- and 0.1 mol/L KCl with the frequencies swept from 104 to 0.1 Hz.

图5 不同Hg2+浓度(a→f：5.0×10-7,1.0×10-7,5.0×10-8,1.0×10-8,5.0×10-9,1.0×10-9 mol/L)下光电流响应信号(内嵌图为I-logcHg2+的校正曲线)Fig.5 I-t curves of different concentration of Hg2+(a→f：5.0×10-7,1.0×10-7,5.0×10-8,1.0×10-8,5.0×10-9,1.0×10-9 mol/L)(Insert:calibration curve of I-logcHg2+)

2.5 特异性、稳定性和重复性实验

图6A为该适配体传感器的特异性测试结果。以金属离子Mn2+、Ni2+、Al3+、Ag+、As3+、Cu2+、Pb2+和Cd2+(浓度均为1.0×10-7mol/L)为干扰离子，考察不同金属离子与该传感界面适配体作用后的光电流响应。在相同实验条件下，所选择的离子对传感器检测几乎没有影响，而Hg2+则产生显著的光电流变化，说明该传感器对Hg2+检测具有良好的选择性。图6B为同一支适配体传感器连续检测10次的稳定性测试结果，其光电流响应未发生明显的变化，相对标准偏差(RSD)为4.01%。图6C为相同实验条件制备的7支适配体传感器重复性测试，RSD为3.25%，说明其重复性好。

图6 不同干扰离子的光电响应(A)、稳定性能测试(B)和重复性能测试(C)Fig.6 Photocurrent change of the biosensor with different metal ions(A),stability test (B) and repeatability test(C)

2.6 实际样品的检测

采用标准加入法，进一步考察所制备的传感器在实际环境样品检测中的应用。取实验室自来水水样，经微孔滤膜过滤后按本法测试，结果如表1所示，回收率范围为95.0%～108.4%，说明该传感器的检测结果令人满意。

表1 标准加入法测定水样品中的Hg2+浓度Table 1 Recovery measurements of Hg2+ in water sample

3 结论

本文报道了一种基于纳米TiO2和Au纳米星的光电化学适配体传感器特异性检测Hg2+的方法。该方法以ITO导电玻璃为基底电极，以纳米TiO2为光电活性物质，以Au纳米星作为巯基修饰适配体共价结合的活性位点，通过Au-S共价键有效固定适配体，通过Hg2+与适配体的特异性结合来实现Hg2+定量检测的目的，方法的检测限为3.1×10-10mol/L。该传感器制备方法简单，且具有较强的特异性、良好的稳定性和重复性，为Hg2+检测提供了一种经济省时的方法，并为环境安全和食品安全的目标物检测应用提供了有力的实验基础。