多粘类芽孢杆菌HY96-2胞外多糖的分离纯化

贾 杰 郑瑞峰 李淑兰 张道敬*

(1.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海 200237；2.上海泽元海洋生物技术有限公司上海 200237)

多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa,P.polymyxa)属芽孢杆菌科(Bacillaceae)，为类芽孢杆菌属(Paenibacillus)，在划入类芽孢杆菌属(Paenibacillus)之前又称Bacilluspolymyxa。Ash等采用PCR探针对Bacillus的一些种进行了16S rRNA分析[1]，将其中的一些种归到一个新属Paenibacillus中，其中P.polymyxa就属此列。本实验室从南昌郊区番茄根际分离得到一株生防菌P.polymyxaHY96-2。由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)鉴定并保藏(保藏号为No.0829)。以生防菌多粘类芽孢杆菌HY96-2为主要活性成分，创制了世界上第一个以类芽孢杆菌为有效成分0.1亿CFU/g多粘类芽孢杆菌细粒剂(农药登记证号：PD20096844)及10亿CFU/g多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂(农药登记证号：PD20140273)系列微生物农药，该农药对青枯病、枯萎病、角斑病、炭疽病等植物土传和叶部病害均具有良好的防治效果。

在P.polymyxa培养过程中，会产生大量的胞外多糖。研究表明，P.polymyxa产胞外多糖具有净化水质[2]、吸收水溶液中的镉元素[3]、增强牲畜的低抗力和激活巨噬细胞等能力[4，5]。另外一些研究结果表明P.polymyxa产胞外多糖具有明显的抗氧化活性[6-8]、促进小麦生长的功效[9]以及抗肿瘤活性[10]。与此同时，P.polymyxa产胞外多糖具有优良的性质，与市场上畅销产品黄原胶特性相似，具有低浓度下高黏性、假塑性和耐盐性，同时对热及酸碱有较好的稳定性[11]。目前，也有学者通过基因研究来提高P.polymyxa胞外多糖的产量[12]。P.polymyxa产胞外多糖在农药助剂方面也有一定的功能，但报道甚少。只有本研究室刘振华等研究过P.polymyxaHY96-2产胞外多糖在农药助剂方面的相关功能，包括助悬浮、紫外保护和热保护作用[13，14]。但上述功能实验所添加的是纯度不高的粗多糖，其中含有相当比例的杂质。为了能得到纯度较高的多糖，亟需开展多粘类芽孢杆菌HY96-2所产胞外多糖的分离纯化，以明确胞外多糖的结构、功能和用途。

目前分离多糖的主要手段是经离心、抽滤、有机溶剂沉淀和去蛋白等步骤后得到粗多糖，而后再利用凝胶柱层析、离子交换柱层析等手段对粗多糖进行纯化，得到较纯的多糖样品，然后对其进行结构鉴定和理化性质等方面的研究。一些文献报道[7,8,15,16]都是通过这种方法来对多糖进行提纯及分析的。其他菌种所产胞外多糖也大都采用此类方法进行分离纯化[17]。南京农业大学的刘俊[19]对一株多粘类芽孢杆菌EJS-3产胞外多糖进行了类似的研究，通过红外光谱、核磁共振等方法初步探究了EJS-3产胞外多糖的结构性质，但仍然未能完成对多糖结构的解析。除此之外，南京理工大学的曹红阳等[20]和蹇华丽等[21]也对多粘类芽孢杆菌产胞外多糖进行了结构分析，但都局限于对多糖的构型和其多糖种类进行判断。本文中多糖的单糖组成分析与曹永强等[22]的研究类似，主要对P.polymyxaHY96-2产胞外多糖进行了分离纯化，为其在农药助剂方面相关功能研究和大规模应用奠定基础。

1 实验部分

1.1 主要仪器、试剂及材料

1200 series高效液相色谱仪(美国，Agilent)；GC-14BPF气相色谱仪(日本，岛津)；YM-75压力蒸汽灭菌器(上海三申医疗器械有限公司)；AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；HYG-Ⅱa迴转式恒温调速摇瓶柜(上海欣蕊自动化设备有限公司)；TU-1810紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；722可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)；BSZ-100自动部分收集器(上海青浦沪西仪器厂)。

三氟乙酸、H2SO4、苯酚、HCl(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；NaOH、NaCl、葡萄糖(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)。实验中所用有机溶剂均为分析纯。水由SZ-93蒸馏水制备仪(上海亚荣生化仪器厂)制备。

多粘类芽孢杆菌HY96-2，由华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室保存。

1.2 实验方法

1.2.1 多糖粗提取物的制备多糖粗提物的提取根据刘振华等[13]和夏泉等[18]的方法并加以改进：取HY96-2菌株发酵液，80 ℃水浴2 h，离心取上清，加入1倍体积的乙醇，生成的絮状沉淀用水溶解后，再用1倍体积的乙醇沉淀，然后按沉淀∶Sevag试剂=5∶1的比例加入Sevag试剂，放置摇床中，以200 r/min摇10 min，取出，移至分液漏斗中静置，分取水相(弃去有机相和水相交界处乳化层)，重复该步骤4次。将最后絮状沉淀置于80 ℃烘箱烘干，得到多糖粗提物。

1.2.2 多糖的纯化取多糖粗提物样品2 g，用水还原至1 L，沸水加热10 min后离心，取上清。向上清中加入10%的三氟乙酸，静置5 h后离心，取上清并用NaOH溶液调节pH至中性，而后用截留分子量为14 000的透析袋透析24 h，期间12 h换水一次。

将透析获得的样品配制成1.5 mg/mL的溶液，过DEAE-52离子交换柱。用8个浓度梯度(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mol/L)NaCl溶液进行洗脱，每个梯度用40根试管接收，每管接15 mL(利用自动分部收集器进行收集)，共收集320管，并测定第1、5、10、15……320根接收管中的多糖浓度。0 mol/L NaCl溶液洗脱的第20～25管合并后为组分B，0.5 mol/L NaCl溶液洗脱的第47～53管合并后为组分D。

1.2.3 多糖纯度和分子量测定组分B和组分D分别经高效液相色谱法检测它们的纯度，并利用pullulan多糖作为分子量标准物质来测定它们的分子量。凝胶渗透色谱(GPC)用Shodex sugar KS 805、804两根多糖专用色谱柱(柱长300 mm，内径8 mm，排阻限分别为5.0×106和4.0×105Da)串联，以0.1 mol/L NaNO3溶液为流动相，流速为0.5 mL/min，温度25 ℃，示差折光检测器检测。

1.2.4 多糖组分分析样品预处理：取B组分15 mg(1.2.2项下所得，多糖纯度91.4%)用14 000透析袋透析24 h(12 h换一次水)，所得样品冷冻干燥，留作后续实验。水解及衍生化：移取2 mg样品，加入2 mL 2 mol/L三氟乙酸，封管，在110 ℃下加热水解2 h，减压蒸发除去三氟乙酸，将水解产物溶于2 mL 水中，加25 mg NaBH4，在室温下还原3.5 h，滴加25%乙酸至不再有气泡产生，减压蒸干。加入乙酸酐2 mL，在100 ℃反应1 h，反复加甲苯，减压蒸发至完全干燥。用10 mL氯仿萃取，再以10 mL水洗涤3次，氯仿层用无水NaSO4干燥，然后减压浓缩至适当体积，进行气相色谱(GC)分析。

2 结果与讨论

2.1 DEAE-52离子交换柱洗脱结果

图1 总糖浓度随管数变化图Fig.1 Total sugar concentration changes with the number of tubes

将1.2.2项下所获得的样品配制成1.5 mg/mL的溶液，过DEAE-52离子交换柱。经1.2.2项下的方法进行梯度洗脱，每个梯度浓度NaCl溶液洗脱用40根试管接收，共得到320根接收管。测定第5、10、15……320号接收管中的总糖浓度。实验结果显示：总糖在少数几根接收管中具有较高的浓度，如第10管、第50管、第120管和第265管，其总糖浓度分别为43.089 μg/mL、47.247 μg/mL、51.632 μg/mL和19.729 μg/mL，而这四根接收管是在不同梯度的NaCl溶液洗脱下得到的；即使在同一梯度下，经NaCl溶液洗脱得到的多糖并没有集中在个别接收管中，而是分布在不同的接收管中，可见各个接收管中的总糖浓度不尽相同。这些均说明不同浓度的NaCl溶液对HY96-2胞外多糖具有较好的洗脱效果。图1直观地反映出不同接收管中总糖浓度的区别，并且可以看出在不同浓度NaCl溶液的洗脱下，没有出现总糖浓度高点相互重叠的现象，这更充分地说明了DEAE-52离子交换柱对多糖具有良好的分离效果。同时，利用不同浓度的NaCl溶液进行洗脱时，每个浓度梯度下都会出现总糖浓度较高的接收管。0 mol/L NaCl洗脱时，出现3个洗脱峰；0.5 mol/L NaCl洗脱时，出现2个洗脱峰；1.0 mol/L NaCl洗脱时，有4个洗脱峰；1.5 mol/L NaCl洗脱时，有1个洗脱峰；2.0 mol/L NaCl洗脱时，0个洗脱峰；2.5 mol/L NaCl洗脱时，有1个洗脱峰，NaCl洗脱浓度进一步提高时则没有出现高浓度的总糖接收管。

为了进一步对分离得到的多糖进行分析，将出现洗脱峰及其邻近的接收管进行合并。将获得的A、B、C、D、E、F和G这7个组分进行真空冷冻干燥，称重后置于4 ℃冰箱保存备用。从表1可以看出，组分A、B和D是合并后的量比较多的3个组分，但根据冷冻干燥后各组分的色泽来看，由于A组分为第一个梯度洗脱下来的组分，颜色较深，而组分B、D从感官上可以看出色泽较淡，近无色，初步判断较其它组分的纯度要高，因此选择组分B和D作为下一步的研究对象。

表1 高浓度总糖的合并与编号Table 1 The combination and numbering of high concentration total sugar

2.2 多糖纯度和分子量的测定

在1.2.3项的实验条件下测定组分B和组分D。组分B的GPC图谱中主要有三个峰，保留时间分别为18.317 min、26.774 min和27.610 min，结果见图2。组分D的GPC图谱中主要有三个峰，保留时间分别为18.314 min、26.765 min和27.621 min，结果见图3。根据图2、图3的峰面积分布，可得组分B纯度：73.1786/(73.1786+6.8974)=91.39%；组分D纯度：26.5574/(26.5574+21.4726)=55.29%。从结果可以看出，组分B的纯度较组分D的纯度高，所以选择组分B进行进一步的分析。

根据GPC软件计算，组分B位于18.317 min处的1#峰其多糖对应重均分子量为1.22×106Da，位于26.774 min处的2#峰其多糖对应重均分子量为2.42×103Da，源于寡糖或其他较小的分子，27.610 min处色谱峰为溶剂峰。

图2 组分B的凝胶渗透色谱图谱Fig.2 Gel permeation chromatogram of component B

图3 组分D的凝胶渗透色谱图Fig.3 Gel permeation chromatogram of component D

2.3 多糖组分B的单糖组成分析

根据2.2节中的结果，组分B的纯度较高，采用1.2.4项的方法分析组分B中的单糖组成，得组分B的气相色谱图，如图4所示。通过与相应标准品的气相色谱图进行比对和分析，出峰时间和相应标准品分别对应，即保留时间为5.383 min的为鼠李糖、7.976 min为木糖、15.178 min为甘露糖、16.640 min为半乳糖、18.146 min为葡萄糖，再根据面积归一法确定单糖之间的摩尔比为2.52∶0.25∶1∶1.61∶2.24。从各单糖的摩尔比可以看出，其中所占比例较高的是葡萄糖和鼠李糖，这对于HY96-2产胞外多糖的发酵工艺的优化具有指导作用，尤其是在进行培养基优化时，可以优先考虑利用葡萄糖和鼠李糖作为备选碳源来进行优化以提高该组分的含量。

图4 组分B的气相色谱图Fig.4 Gas chromatogram of component B

3 结论

经过本文的研究，初步得到纯度较高的HY96-2产胞外多糖，其中组分B的纯度为91.4%，进一步对组分B的单糖组成进行了分析，发现其含有5种单糖：鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖，它们的摩尔为2.52∶0.25∶1∶1.61∶2.24。为了更好的对其功能进行研究和开发利用，接下来将继续对HY96-2产胞外多糖组分B进行深入结构分析。同时，通过本文分离方法制备足够量多糖来开展纯品活性研究，以明确高纯度多糖是否具备助悬浮、紫外保护和热保护作用等功能，为HY96-2胞外多糖进一步应用研究奠定基础。