基于相关性分析的金银花和山银花正丁醇提取物的抗肿瘤活性谱-效关系研究

2020-03-20张水寒沈冰冰袁清照

分析科学学报 2020年1期

万丹张水寒沈冰冰袁清照蔡萍*

(1.湖南省中医药研究院湖南长沙 410013；2.湖南省中药原料质量监测技术服务中心湖南长沙 410013；3.湖南省2011数字中医药协同创新中心湖南长沙 410013)

金银花为忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或带初开的花。山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬(Loniceramacranthoides)、红腺忍冬(LonicerahypoglaucaMiq.)、华南忍冬(LoniceraConfusaDC.)或黄褐毛忍冬(LonicerafulvotomentosaHsu et S.C.Cheng)的干燥花蕾或带初开的花，具有疏风散热、凉血解毒的功效，其主要化学成分有咖啡酰基奎宁酸类[1]、黄酮类[2]、环烯醚萜类以及皂苷类[3]。现代药理研究表明金银花具有抗肿瘤[4]、保肝、抗炎以及抗菌[5]等多种生理活性，但对其抗肿瘤物质基础的研究较少。

本研究以金银花和山银花为对象，采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法对它们的正丁醇提取物进行分析，并建立它们正丁醇提取物的HPLC指纹图谱，比较主要化学成分的异同，同时对其抗肿瘤活性进行评价，采用最小二乘法计算指纹图谱特征峰与抗肿瘤作用的关联度。运用建立的“谱-效”相关性模型能较好地体现金银花、山银花的物质成分与抗肿瘤活性之间的相关性，从而为阐明其抗肿瘤作用的药效物质基础提供依据。

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

Agilent 6530型液-质联用仪、Agilent Technologies 1290 Infinity型高效液相色谱仪(美国，Agilent公司)；Mettler Toledo XPE105型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；Thermo Fisher-Multiskan FC酶标仪。

人乳腺癌细胞株(Mcf-7)、人子宫颈癌细胞株(Hela)、人结肠癌细胞株(Ht29)均购自中科院上海细胞生物研究所；灰毡毛忍冬皂苷乙(批号：111814-201604)、川续断皂苷乙(批号：111813-201403)对照品均购自中国食品药品检定研究院；乙醇、正丁醇均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯，德国默克化工技术有限公司)。

4批药材经湖南省中医药研究院刘浩助理研究员鉴定为:灰毡毛忍冬(Loniceramacranthoides,湖南隆回)、红腺忍冬(LonicerahypoglaucaMiq.,广西都安)、黄褐毛忍冬(LonicerafulvotomentosaHsu et S.C.Cheng,广西隆林)、忍冬(LonicerajaponicaThunb.,河南封丘)。

1.2 实验方法

1.2.1 正丁醇提取物的制备称取已粉碎的4个样品各200 g，以料液比1∶8 加入70%乙醇，于70 ℃回流提取1.5 h，提取3次，过滤，合并提取液，浓缩干燥后得醇提浸膏。将该浸膏加水分散至质量浓度为0.5 g/mL，加入正丁醇∶浸膏分散液=1∶1(V/V)萃取3次，移出正定醇层，蒸干，加少量水溶解，冷冻干燥，即得。

1.2.2 供试品溶液制备精密称取4种正丁醇提取物，加甲醇溶解并定容后，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，进行HPLC-Q-TOF-MS/MS分析。

1.2.3 对照品溶液配制取灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙对照品适量，加入甲醇，分别配制成浓度为0.1 μg/mL的对照品溶液。

1.2.4 HPLC-MS/MS条件采用InertSustain-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，以0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B)作为流动相，采用梯度洗脱模式：0～10 min，7%～11.5%B；10～12 min，11.5%～20%B；12～30 min，20%～29%B；30～45 min，29%～31%B；45～48 min，31%～45%B。流速：1 mL/min，柱温：30 ℃，紫外检测波长：207 nm，进样量：10 μL。质谱采用电喷雾电离，正、负离子(ESI+、ESI-)模式，扫描范围m/z100～1 800。扫描方式：全扫描和选择离子扫描，雾化气温度：320 ℃，干燥气流速：8 L/min，鞘气(N2)温度：320 ℃，鞘气流速：11 L/min，碎裂电压：185 V。

1.2.5 体外抗肿瘤活性实验取提取物和对照抗肿瘤药顺铂，用DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)分别配成不同浓度的供试液，取对数生长期的Mcf-7、Hela、Ht29，消化制成单细胞悬液，调整浓度为2.0×104cell/mL，每孔100 μL细胞悬液，接种于96孔培养板中。隔夜培养后加入供试液。培养48 h后，每孔加入0.5 mg/mL噻唑蓝(MTT)工作液20 μL，孵育4 h，去除上清后，加入150 μL/hole二甲基亚砜(DMSO)，于旋涡振荡器上振荡10 min充分溶解结晶。然后在酶标仪上，于570 nm波长处测定每孔的吸光度值(OD)。细胞增殖抑制率=(对照组OD值-药物组OD值)/对照组OD值×100%。依次计算药物对癌细胞的半数抑制浓度(Ic50)。

2 结果与讨论

2.1 色谱峰的归属[6-10]

按照1.2.2方法制备得到样本，采用HPLC-MS/MS法进行分析检测，以正、负离子扫描方式采集质谱信息，ESI-模式下的总离子流色谱图见图1。对其特征峰进行定性分析，结合对照品和文献信息共鉴定出31个化合物(表1)。

图1 各提取物ESI-模式的总离子流色谱图Fig.1 Total ion current chromatograms of each extracts in ESI- modea.Lonicera hypoglauca Miq.;b.Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng;c.Lonicera macranthoides Hand.-Mazz;d.Lonicera japonica Thunb..

表1 各提取物的化学成分鉴定Table 1 Identification of chemical constituents of each extracts

+:detected.

2.2 体外抗肿瘤活性

按照1.2.5项进行各样品的体外抗肿瘤活性测试，Mcf-7、Hela、Ht29三个细胞株的结果见表2。由表2可知，各样品有一定的抗肿瘤活性，其中红腺忍冬对Mcf-7的效果与药物顺铂相当。

表2 各提取物对三种人体肿瘤细胞株的抑制作用(Ic50)Table 2 Growth inhibition of each extract against three human tumor cell lines(Ic50)

2.3 正丁醇提取物指纹图谱与抗肿瘤活性的相关性分析[11 - 13]

对4个样品在3个不同浓度(100 μg/mL、50 μg/mL、1 μg/mL，构建为矩阵X)的抗肿瘤活性进行测试，分别得到不同浓度下的活性值(构建为活性矩阵Y)。结果表明：Mcf-7和Ht29细胞系实验中抗肿瘤活性之间存在明显的相关性，拟合相关系数(R2)分别达到了0.9681和0.9673，说明样品的物质成分与抗肿瘤活性之间存在明显的相关性。以实验结果与拟合的结果分别为横坐标和纵坐标作图，得到图2和图3。在建立拟合模型的过程中，得到每个物质的拟合系数，从而明确每个物质对抗肿瘤活性贡献度。从图4中可见，峰8(断氧化马钱子苷)、峰20(3,4-二咖啡酰奎宁酸)、峰29(川续断皂苷乙)等具有较高的抗肿瘤活性贡献度，是其抗肿瘤活性的主要来源。有研究发现3,4-二咖啡酰奎宁酸能抑制MCF-7的生长和增殖，诱导MCF-7发生凋亡，这与本实验中发现3,4-二咖啡酰奎宁酸具有抗肿瘤活性结论一致。