高效液相色谱法同时测定桑姜感冒片中3种成分的含量

姚 璐，于 蕾，潘若婕，郝乘仪

(吉林医药学院，吉林 吉林 132013)

桑姜感冒片是由桑叶、连翘、菊花、苦杏仁、紫苏叶、干姜这6种中药所制得，配方源于中医药传统理论组方，以桑菊饮的配方为基础方，在此加减而成，具有散风清热、祛寒止咳的功效，为2015版《中国药典》所收录的品种[1]。

方中桑叶具有疏散风热、清肝明目的作用，可清肝热肺热，能够治疗因肺热引起的发热、咳嗽、咽痒等症状，还可凉血止血;菊花能够疏散风热和清热解毒;连翘有清热解毒、排脓消肿的功效，可治火郁;苦杏仁能够止咳平喘、降气、润肠通便;紫苏叶有发散风寒、具有理气宽中的作用;干姜辛热，具有温中散寒、回阳通脉、温肺化饮的功效[2-4]。六味中药共同作用，温清并用，桑叶、连翘、菊花的凉寒借苦杏仁、紫苏叶、干姜之温，避免了伤阳，而苦杏仁、紫苏叶、干姜的辛热借桑叶、连翘、菊花之凉避免了伤津从而达到很好的治疗效果[5-6]。方中的桑叶和菊花中含有的绿原酸具有抑制脂肪酸合成、降血糖、抗氧化、杀菌增强免疫力等作用;菊花中的黄芩苷具有抗炎、解热、降压、镇静、抗变态等作用;连翘中的连翘苷具有抗氧化、解热、抗炎、抗菌、抗病毒、降血脂等作用[7-8]。

在2015版《中国药典》中仅有测量桑姜感冒片中连翘苷含量的方法。为避免不良生产厂家仅以连翘苷的含量作为生产标准、而减少其他有效成分的含量从而降低了治疗效果，本实验建立了测定桑姜感冒片中3种成分的含量的方法，同时测定桑姜感冒片中绿原酸、黄芩苷、连翘苷的含量，提高检测效率，从而使对该药品的质量控制更加全面，对桑姜感冒片制剂检测提供了一定的补充。

1 实验材料

1.1 实验药品

桑姜感冒片(四川好医生攀西药业有限公司)，绿原酸标准品(批号110753—201817，中国食品药品鉴定研究院)，黄芩苷标准品(批号110715—201821，中国食品药品鉴定研究院)，连翘苷标准品(批号110821—201816，中国食品药品鉴定研究院)，甲醇(色谱纯，天津市致远化学试剂有限公司)，乙腈(色谱纯，天津市致远化学试剂有限公司)，磷酸(色谱纯，天津市致远化学试剂有限公司)。

1.2 实验仪器

PLATSILTMODS色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪，SPD-20A紫外检测器，岛津LC-solution工作站，CBM20A系统控制器，SIL-20A自动进样器，CTO-20A型柱温箱，LC-20AT二元泵，DGU-20A脱气机，SPD-M20A二极管阵列检测器，ESJ200-4B型电子天平(赛多利斯)，KQ-500GVDV型三频恒温数控超声波清洗器(功率250 W,昆山市超声仪器有限公司)，电热恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂)，微孔滤膜(0.45 μm)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，采用梯度洗脱(1～18 min,10%-20%A;18～42 min,20%-70%A)，流速为1 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为278 nm，进样量20 μL。在此色谱条件下,绿原酸、黄芩苷、连翘苷的分离度均大于1.5，塔板理论数均大于3000。阴性对照在其对应的保留时间内也未出峰,混合对照品溶液及样品溶液色谱图见图1。

1.绿原酸；2.黄芩苷；3.连翘

2.2 混合对照品溶液的制备

根据样品中绿原酸、黄芩苷、连翘苷峰面积与单一标准品峰面积对比，配置混合标准品溶液。

取0.198 g/L的绿原酸标准品溶液2 mL、0.136 g/L的黄芩苷标准品溶液4 mL、0.98 mg连翘苷标准品放入10 mL容量瓶中，用甲醇定容，再进行超声处理1 min，即得混合标准品溶液。在“2.1”色谱条件下，进样20 μL。

2.3 供试品溶液的制备

取桑姜感冒片，去糖衣，研细至粉末，精密称取0.998 45 g，置于250 mL磨口锥形瓶中，加入20 mL的甲醇，摇晃震荡后，超声波处理60 min，冷却后经微孔滤膜过滤即得。在“2.1”色谱条件下，进样20 μL。

2.4 方法学验证

2.4.1线性考察

取混合标准品溶液，向高效液相色谱仪中分别进样1、5、10、20、25 μL，以混合标准品溶液进样量(x)为横坐标,其峰面积(y)为纵坐标,进行线性回归，得到标准曲线。回归方程分别如下:

绿原酸y=74 124x+66 077，R2=0.992 1

黄芩苷y=164 723x-34.647，R2=0.999 6

连翘苷y=93 937x+5 160.8，R2=0.999 5

2.4.2精密度实验

取混合标准品溶液，在“2.1”的色谱条件下，连续6次精密进样20 μL，由此得到该6次的绿原酸、黄芩苷、连翘苷的峰面积，经计算可得出绿原酸、黄芩苷、连翘苷的精密度RSD(n=6)分别为1.3%、1.4%、0.7%。可以确定所使用的仪器具有良好的精密性。

2.4.3稳定性实验

将制得的供试品溶液分别于0、2、4、8、12、24 h时进行进样测定，得到不同时间进样的绿原酸、黄芩苷、连翘苷的峰面积，进行计算可得出绿原酸、黄芩苷、连翘苷的稳定性RSD(n=6)分别为1.2%、1.6%、0.6%。说明24 h内，该桑姜感冒片样品溶液稳定性较好。

2.4.4线性考察

重复性实验取桑姜感冒片，精密称取，按“2.3”项下的方法制得6个供试品溶液，在“2.1”色谱条件下分别进样20 μL，由此得到该6次的绿原酸、黄芩苷、连翘苷的峰面积，经计算可得出绿原酸、黄芩苷、连翘苷的重复性RSD(n=6)分别为1.6%、0.6%、0.9%。说明该试验方法有较好的重复性。

2.4.5加样回收率实验

取足量的桑姜感冒片，除去外包糖衣，研细至粉末，用电子天平精密称取6份，为0.528 5、0.502 1、0.514 0、0.508 7、0.497 5、0.483 3 g，分别加入相当于样品中绿原酸、黄芩苷、连翘苷含有量100%的适量的标准品溶液6份，按“2.3”项下的方法制得6个供试品溶液，进样20 μL，得到色谱图。分别计算得出绿原酸、黄芩苷、连翘苷的加样回收率以及其RSD值,分别为102.11%(RSD 1.51%)、95.99%(RSD 1.87%)、99.82%(RSD 1.64%)。

3 讨 论

在2015版药典中仅有测量桑姜感冒片中连翘苷含量的方法。为了更好更全面地对桑姜感冒片进行质量把控，本实验建立了同时测定桑姜感冒片中3种成分的含量，使对该药品的质量控制更加全面。

所测的绿原酸、黄芩苷、连翘苷均可溶于甲醇，故选用甲醇进行超声提取。

流动相在乙腈-磷酸和甲醇-磷酸等实验选择做对比，发现使用乙腈-0.1%磷酸作为流动相时，绿原酸、黄芩苷、连翘苷的分离效果好，基线平稳，峰形良好，且理论塔板数和分离度都较好。

切换波长，绿原酸在327 nm处有最大吸收波长，黄芩苷在278 nm处有最大吸收波长，绿原酸在230 nm处有最大吸收波长。在278 nm下绿原酸、黄芩苷、连翘苷的峰形都较好、分离度高、理论塔板数好。可以在同一波长下观察测定更为方便简洁。

采用梯度洗脱，第一梯度洗脱较慢，为了让绿原酸完整出峰，峰形良好。第二梯度洗脱较快，因为所需测得的黄芩苷、连翘苷所需洗脱浓度较高，加快洗脱压缩时间，保证峰形良好的状态下，选择较快时间洗脱，该方法在实际应用上更为方便。