GC-MS分析不同产地花椒挥发性成分

魏泉增，王磊，肖付刚*

(1.许昌学院 食品与生物工程学院,河南 许昌 461000；2.河南省食品安全生物标识快检技术重点实验室,河南 许昌 461000)

花椒是中国传统的调味品之一。花椒中的挥发性有效成分具有温中行气、逐寒、止痛、杀虫、抗肿瘤、麻醉等功效[1-3]。由于花椒产地的差异，导致成熟后花椒的挥发性有效成分有所差异。因此，分析不同产地花椒挥发性成分具有重要意义。气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)、电子鼻技术、气相色谱技术常用来分析挥发性物质[4-7]。罗凯等[8]用GC-MS技术检测分析了4 个不同产地花椒挥发油成分含量的差异。杨峥等[9]利用GC-O技术结合芳香萃取物稀释分析法对金阳青花椒香气活性成分进行检测分析。莫彬彬等[10]用超临界二氧化碳法萃取九叶青花椒挥发油并鉴定出63个化合物。杨静等[11]采用快速气相电子鼻区分不同地区的青花椒。目前，对花椒挥发性成分研究较多[12，13]，但并没有找出特征物质加以区分。本研究比较不同提取方法结合气相色谱-质谱联用技术分析，寻找区分不同产地花椒挥发性成分特征物质，为花椒综合利用提供参考与借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原料：洛阳花椒、汉源花椒、自贡花椒、山东花椒、郑州花椒5种花椒，均购自当地超市，花椒打碎30 s，过40目筛，备用；二氯甲烷:百灵威公司。

7890B-7000C GC/MS气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦科技公司；65 μm ACAR/PDMS(活性炭/聚二甲基硅氧烷)手动固相微萃取装置及萃取探针 青岛贞正分析仪器有限公司；挥发油提取器(500 mL) 郑州兴华玻璃仪器公司；同时蒸馏萃取器(1000 mL) 赛克斯玻璃仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 水蒸气蒸馏法(WD)

称取10.00 g山东花椒，置于250 mL的圆底烧瓶中，加入100 mL的蒸馏水缓慢蒸馏2 h。待冷却至室温后，上层淡黄色液体用0.45 μm有机系滤膜过滤后进行GC-MS分析[14]。

1.2.2 同时蒸馏萃取法(SD)

称取10.00 g山东花椒，置于500 mL的圆底烧瓶中，加入100 mL的蒸馏水，电炉加热。取40 mL的二氯甲烷加入250 mL的圆底烧瓶中，60 ℃水浴加热，同时萃取2 h。用0.45 μm有机系滤膜过滤后进行GC-MS分析。

1.2.3 顶空固相微萃取法(SPME)

取不同产地的花椒样品0.50 g放入15 mL的顶空瓶中，60 ℃水浴恒温平衡30 min，SPME吸附30 min，250 ℃解吸附3 min[15]，进行GC-MS分析。

1.3 气相色谱条件

色谱柱：DB-WAX聚乙二醇(PEG)色谱柱，60 m×0.25 mm×0.25 μm。升温程序：以50 ℃为初始温度，以5 ℃/min升至100 ℃，以2 ℃/min 升至110 ℃，以5 ℃/min升至150 ℃，以4 ℃/min升至180 ℃，保持10 min。载气(He)流速1.2 mL/min，分流比100∶1，汽化室温度250 ℃。液体进样量1 μL，SPME解吸附3 min。

1.4 质谱条件

EI离子源，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，接口温度250 ℃，电子能量70 eV，溶剂延迟6.5 min，扫描方式Scan，质量范围29～700 amu。

1.5 GC-MS数据分析

NIST 14谱库检索，选取匹配度大于80%的物质。以检测到的物质保留时间为有效响应点，以保留时间-峰面积归一化法为数据集，重复3次。采用模型为VaR-CoVaR对不同产地花椒进行PCA分析，相似度采用Dice法进行不同产地花椒聚类分析，根据PCA分析结果，对不同产地花椒进行特征分析。

2 结果与分析

2.1 方法比较

3种提取方法结合GC-MS分析山东产地花椒，结果表明醇类和烯类化合物是花椒香气物质的主要化合物。3种提取方法检测到花椒挥发油化合物种类不同，WD法提取到43种挥发性化合物，SD法提取到37种化合物，SPME提取到41种化合物。

图1 山东产地花椒不同方法提取香气物质Fig.1 Different methods for extraction aroma componentsfrom Zanthoxylum bungeanum in Shandong Province

由图1可知，3种方法都提取到了醇类、烃类、酮类、醛类、烯类和酯类，其中峰面积最大的是WD法，峰面积最小的是SD法；只有SD法提取到醚类，而且峰面积很小；只有WD法提取到酸类；WD法和SPME法提取到烷类。

图2 不同提取方法总离子流图Fig.2 Total ion chromatogram of different extraction methods

由图2可知，WD法、SPME法和SD法的色谱图相似，WD法的色谱图峰高偏高，峰宽较宽，分离度不好，处理时间较长，操作温度较高，会导致新的物质产生，利用NIST库检索物质的匹配度较低。SPME法操作温度适中，操作时间短，库匹配度高，故SPME法较优。

2.2 不同产地花椒挥发性物质比较

SPME法共提取到77个挥发性化合物，见表1，包括17种醇类，2种醛，5种酮，17种烷，27种烯，9种酯类。柠檬烯是含量最多的化合物，郑州花椒最高，达到267.16‰，乙酸芳樟酯次之，达254.56‰。但不同产地花椒挥发性种类含量差异明显(见图3)，醇类化合物中洛阳花椒含量最多，自贡花椒最少。烯类化合物中郑州花椒含量最多，山东花椒含量最少。酮类化合物山东花椒含量最多，自贡花椒含量最少。酯类化合物自贡花椒最多，山东花椒最少。5种产地中烯类化合物含量最多，其次是醇类化合物，酮类和酯类化合物相对较少，这与杨潇等的分析结果相似[16]。5个产地都检测到萜二烯、3-亚甲基-6-(1-甲基乙基)环己烯、1,5,9,9-四甲基-α-丁子香烯和双环[1]庚-2-烯，3,6,6-三甲基烯类化合物中。5个产地都检测的醇类化合物3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇、芳樟醇、桉油精。乙酸芳樟酯在5个产地都检测到。5个产地共有的酮类化合物为4-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-酮。不同产地花椒的相对含量差异较大，例如，乙酸松油酯在汉源花椒中含量达到138.46‰，在洛阳花椒中达77.51‰，在山东花椒中达49.9‰，郑州和自贡花椒含量相似分别为29.71‰、28.01‰。同时，不同产地提取一些特有化合物，δ-松油醇只在汉源花椒中检测到，对甲基苯异丙醇只在洛阳花椒中检测到，3-(4-甲基-3-戊烯基)-呋喃只在郑州花椒中检测到，乙酸辛酯只在山东花椒中检测到，这为区分不同产地的花椒提供了参考依据。

图3 SPME法不同产地花椒挥发性香气种类分布图Fig.3 Distribution of volatile aroma components' types ofZanthoxylum bungeanum from different producingareas by SPME method

表1 SPME提取不同产地花椒挥发性物质Table 1 Extraction of volatile components from Zanthoxylum bungeanum in different producing areas by SPME ‰

续 表

续 表

注：“-”表示未检出。

2.3 聚类分析

5个产地的花椒挥发性物质聚类分析见图4。15个样品分成3组，1组自贡样品，2组郑州和汉源样品，3组洛阳和山东样品，郑州和汉源花椒香气成分相似度较高，而洛阳和山东花椒相似度较高，自贡与其他产地花椒相似度较小。

由图4可知，郑州和汉源的相似度为0.62，洛阳和山东的相似度为0.64，自贡和其他产地的花椒相似度为0.51，结果表明不同产地花椒挥发性组成差异性明显。

图4 聚类分析图Fig.4 Cluster analysis diagram

2.4 主成分分析

主成分的分析(PCA)是一种降维或者把多个指标转化为少数几个综合指标的一种多元数理统计方法，对5个产地花椒样品进行PCA分析，得到分值图(见图5)和载荷图(见图6)。结果表明第一主成分的贡献率为51.05%，第二主成分的贡献率为21.69%。

图5 花椒分值图Fig.5 Score chart of Zanthoxylum bungeanum

由图5可知，郑州、洛阳、山东、自贡、汉源5个产地具有明显差异，这为区分不同产地的花椒提供了潜在的线索。

图6 载荷图 Fig.6 Loading plot

注：图中的数字对应表1中。

由图6可知，被分析化合物对主成分的影响，化合物远离原点表明这个化合物对主成分有强烈的影响，36号物质乙酸芳樟酯和30号物质乙酸松油酯可能成为区分不同产地花椒的关键化合物，为区分不同产地花椒奠定了基础。

3 结论

采用水蒸气蒸馏法(WD)、固相微萃取法(SPME)和同时蒸馏法(SD)3种提取方法结合GC-MS分析山东花椒挥发性化合物组成，SPME提取方法最优。采用SPME提取法结合GC-MS分析5个产地花椒，共鉴定到77种化合物。其中，乙酸熏衣草酯是山东产地花椒独有的酯类化合物，香芹酮是自贡花椒独有的酮类化合物，香叶基乙烯基醚是山东产地独有的醚类化合物，柠檬烯是花椒主要的化合物，含量高。聚类分析和主成分分析表明不同产地之间香味物质的差异明显；乙酸芳樟酯和乙酸松油酯成为区分不同产地花椒的潜在关键化合物。