秀丽莓茎、叶中原花青素测定

朱甜甜，胡 玲，童金枝，赵金亮，金 勇，童 丽，孙 敏*

（1.安徽大学生命科学学院，安徽 合肥 230601；2.青海大学医学院，青海西宁 810001）

秀丽莓（Rubus amabilis Focke）属于蔷薇科悬钩子属植物，主要分布于青海、甘肃、陕西等地，资源非常丰富，在藏药中被称为“甘扎嘎日”，具有清热解毒的功效，藏医典籍《月王药诊》《四部医典》和《晶珠本草》中均有记载。有研究［1-5］表明秀丽莓植物中含有多种化学成分，主要包括黄酮、萜、鞣质，以及少量醌、有机酸、生物碱等。原花青素是一类有着特殊分子结构的生物类黄酮物质，起初称为黄烷醇类或归于缩合鞣质，广泛存在于各种植物的果皮、种子或果核中，如:葡萄籽、银杏叶、蓝莓、黑莓等植物。大量研究［6-10］表明原花青素具有抗氧化和自由基清除、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗辐射等药理学活性，广泛应用于各类保健食品与化妆品中。原花青素通常是由儿茶素或表儿茶素等单体聚合而成。目前测定原花青素的方法有多种，如盐酸-正丁醇法、紫外分光光度法、原子吸收法、铁盐催化法［11］、钼酸铵分光光度法［12］、4- 二甲基氨基肉桂醛（4-Dimethylaminocinnamaldehyde DMAC）法［13］、香草醛 - 强酸法［14］等，由于这些方法反应原理不同，有各自的优缺点。因此本研究比较了常用的测定方法，香草醛法和DMAC法测定秀丽莓茎、叶中原花青素含量，寻找适合秀丽莓中原花青素的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

（1）秀丽莓于2018年采自青海果洛；儿茶素，纯度＞98%（上海麦克林生化科技有限公司）；原花青素B2，纯度＞98%（合肥博美生物科技责任有限公司）；香草醛（上海展云化工有限公司）；DMAC（上海麦克林生化科技有限公司）。盐酸、硫酸、甲醇、乙醇均为国产分析纯试剂。

（2）UV5100B紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；BS-224S电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；Gynergy HI多功能酶标仪（美国BioTek公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制

（1）儿茶素标准溶液的配制。取儿茶素粉末，以91%乙醇为溶剂，配制成浓度为1 mg/mL，稀释至2、4、6、8、10 μg/mL 和50、100、150、200、250 μg/mL 分别作为 DMAC 法和香草醛法的标准溶液。

（2）原花青素B2标准溶液的配制。取原花青素B2，以91%乙醇为溶剂，配制成浓度为1 mg/mL，稀释至15、30、45、60、75 μg/mL 和150、225、300、375、450 μg/mL 分别作为 DMAC 法和香草醛法的标准溶液。

1.2.2 秀丽莓茎、叶提取液的制备

秀丽莓茎或叶粉碎，过40目筛，精准称取1 g茎或叶，分别用20 mL丙酮—水（1∶1）浸泡混匀，室温下超声30 min，离心取上清，滤渣再加入10 mL丙酮—水（1∶1）超声30 min离心取上清，合并两次上清，定容至50 mL。

1.2.3 原花青素含量计算

原花青素提取量计算公式:

原花青素提取量（mg/g）=（V×D ×C）/（1 000×S）

式中:V为秀丽莓茎或叶提取液体积（mL）；D为提取液稀释倍数；C为样品提取液的质量浓度（mg/mL）；S 为秀丽莓质量（g）。

1.2.4 DMAC法

（1）DMAC溶液（0.1%）的配制。以浓盐酸—蒸馏水—乙醇（91%）按照25∶25∶150（V/V）的比例配制酸性乙醇，该溶液在18～25℃下可以稳定一年。精密称量0.05 g DMAC加入50 mL酸性乙醇，该试剂现用现配。

（2）DMAC法测定。取70μL的标准品或者适当稀释的原花青素提取液和210μL DMAC溶液加入到96孔板，放置提前设置好的酶标仪中，在25℃、640 nm波长［13］下扫描45 min内的吸光值，扫描间隔为1 min，摸索最佳孵育时间。以标准品浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.5 香草醛法

（1）显色剂的配制。均以甲醇为溶剂，配制质量分数为30 mg/mL的香草醛溶液和体积分数为30%的浓硫酸。

（2）香草醛法测定。取标准品、适当稀释的原花青素提取液按表1分别配制成样品组、样品空白组、蒸馏水空白组。摇匀混合液，25℃下避光孵育20 min［14］，在紫外可见分光光度计500 nm波长［14-15］下测量吸光值。以标准品浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

表1 香草醛-硫酸法各组溶液配制量表Tab.1 Preparation of vanillin-sulfuric acid solution mL

2 结果与分析

2.1 DMAC与儿茶素和原花青素 B2生化反应的适宜时间图1为45 min内DMAC与不同浓度儿茶素、原花青素B2反应的吸光度随时间变化曲线。由图1可以看出，DMAC与儿茶素、原花青素B2在25～35 min内吸光度数值比较稳定，因此本实验将以30 min为DMAC与儿茶素、原花青素B2的反应时间。

2.2 标准曲线的绘制用DMAC法，以儿茶素为标准品测得标准曲线如图2a，得到的回归方程:y=0.06x+0.029 1（R2=0.995 9）；以原花青素B2为标准品测得标准曲线如图2b，得到的回归方程:y=0.008 6x+0.085 8（R2=0.997）。

用香草醛法测原花青素含量，以儿茶素为标准品测得标准曲线如图3a，得到的回归方程:y=0.004 1x+0.006 6（R2=0.999 8）；以原花青素B2为标准品测得标准曲线如图3b，得到的回归方程:y=0.001 7x+0.002（R2=0.993 8）。

2.3 原花青素含量的测定采用香草醛法与DMAC法分别测得秀丽莓茎、叶的吸光值并将该吸光值代入分别以儿茶素、原花青素B2为标准品的回归方程得到秀丽莓茎、叶中原花青素含量见表2。

表2 秀丽莓茎、叶中原花青素含量（n=3）Tab.2 The content of proanthocyanidins in stems and leaves of Rubus amabilis Focke（n=3）

由表2可以看出，香草醛法测得的原花青素含量明显偏高。以儿茶素或者原花青素B2为标准品，由DMAC法生成的缩合物摩尔吸光度均高于香草醛法生成的缩合物摩尔吸光度，即DMAC法的灵敏度要高于香草醛法。

2.4 香草醛法与DMAC法测原花青素反应原理DMAC法测原花青素反应原理（图4），DMAC只与原花青素终端单元酚羟基反应［15］，在640 nm处有最大吸收峰。香草醛法测定原花青素的原理（图5）是基于酚醛缩合反应，原花青素A苯环上化学活性较高，在浓酸的催化作用下，其上的间苯二酚或间苯三酚与香草醛发生缩合而形成有色的正碳离子，可吸收可见光，使A环产生红色的发光基团，并于λ=500 nm处有最大吸收峰［16］。

3 讨论与结论

原花青素通常是由不同数量的儿茶素或表儿茶素等单体缩合而成的聚合体。单体之间通过C4—C8或C4—C6键连接而成的聚合物称为B型原花青素；单体之间通过 C2—O—C5或C2—O—C7键连接而成的聚合物称为A型原花青素［17］。由于原花青素结构的复杂性，即其单体具有多种异构体，且聚合度不同而导致其含量难以测定［15］。本试验采用香草醛法和DMAC法测定秀丽莓茎、叶中原花青素含量，两种方法反应原理不同。由香草醛法测定原花青素的反应原理可知香草醛还会与含有儿茶素单体的非原花青素物质反应，因此会导致测量值偏高。Payne等［18］分别从酚酸、黄酮类、黄烷酮类、黄酮醇、花色素、异黄酮、芪类、黄烷醇中挑选一系列化合物与DMAC反应，进一步证实了DMAC与黄烷醇反应的特异性。研究表明，DMAC法比香草醛法专一性强，灵敏性更强。乔洪翔等［19］测定银杏叶制剂中原花青素含量，发现盐酸—香草醛法测得银杏叶制剂中原花青素含量大于真实值；黄文烨等［15］采用香草醛法和DMAC法测定山竹果皮、花萼、果肉中原花青素含量，发现香草醛法测得的原花青素含量是DMAC法的4倍左右，认为香草醛法会使得测定结果偏高。本实验结果同样表明香草醛法测得原花青素含量均比DMAC法高。

本试验中分别采用儿茶素、原花青素B2为标准品，由不同方法计算原花青素含量，以儿茶素为标准品计算所得的原花青素含量低于以原花青素B2为标准品的值。据文献［18］报道，在同样标准品浓度的条件下，由于DMAC与单体和低聚物的反应不同，其中DMAC与原花青素B2反应的吸光值比与儿茶素反应的吸光值低，导致用儿茶素做标准品低估了样品中原花青素含量，因此采用原花青素B2为标准品。由此可知，以原花青素B2为标准品，采用DMAC法更适合作为检测秀丽莓中原花青素含量。