青海省曲麻莱牦牛的母系遗传多样性及遗传背景探究

李广祯，马志杰，陈生梅，杨秋蕾，窦全林，若巴仁青

（1.青海大学畜牧兽医科学院，青海西宁 810016；2.青海大学农牧学院，青海西宁 810016；3.青海省玉树黄河源良种繁育有限公司，青海曲麻莱 815500）

牦牛是青藏高原上的特有物种，以食草为生，生性强悍，具有极强的适应性，可在高海拔、低温、缺氧的恶劣环境中生存自如并世代繁衍。目前，全世界拥有牦牛1 500多万头，其中95%分布在青藏高原及其毗邻地区［1］。线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）具有结构简单稳定、母系遗传、进化速度快等特点。目前，mtDNA中的D-loop区被证明是很好的分子遗传标记［2］，该标记已被用于人［3］、猪［4］和家鼠［5］等物种的起源、进化历史、遗传资源评估等研究。在牦牛mtDNA研究中，马志杰［6］对牦牛mtDNA D-loop区的研究概况进了归纳总结。然而，目前尚未见对曲麻莱牦牛的母系遗传多样性及遗传背景的研究报道。

曲麻莱县位于青海省玉树藏族自治州的东北部，地处长江、黄河源头，是一个纯牧业县，有“江河源头第一县”的美称，牦牛遗传资源丰富。在青海牦牛的父系遗传研究中，Ma等［7］对9个青海牦牛（唐古拉山、天峻、曲麻莱、祁连、郭勒木德、岗龙、雪多、环湖和大通牦牛）的Y染色体单倍型多样性及群体遗传结构研究发现，H1，H2和H6单倍型为所有牦牛品种/群体所共享，H3与H7单倍型仅存在于大通牦牛品种中，H4单倍型存在于曲麻莱、祁连、天峻和岗龙牦牛群体中，而H5单倍型仅存在于曲麻莱牦牛群体中，表明曲麻莱牦牛含有特殊的父系遗传信息。鉴于此，为深入了解曲麻莱牦牛的母系遗传特征，本研究对曲麻莱牦牛mtDNA D-loop区进行测定，在此基础上分析曲麻莱牦牛的母系遗传多样性及遗传背景，为曲麻莱牦牛资源的保护提供理论依据，为其合理的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集与DNA提取

采用颈动脉采血法，在青海省曲麻莱县玉树黄河源良种繁育有限公司所属的牦牛群中随机采集34头牦牛颈静脉血样在实验室用低温冰箱（-20℃）保存。将牦牛血样使用血液DNA提取试剂盒（艾德莱生物科技有限公司，北京）提取DNA，低温保存备用。

1.2 引物设计合成和PCR扩增

使用Ma等［8］在野牦牛研究中运用的引物扩增曲麻莱牦牛mtDNA D-loop区的序列，其上游引物（PF）为 5′-CTACAGTCTCACCGTCAACC-3′，下游引物（PR）为5′-GGGGTGTAGATGCTTGC-3′，引物委托上海生工公司合成。

PCR反应体系（25μL）为2×PrimeSTAR Max Premix（上海宝生物公司）10.5μL，超纯水12.5μL，上、下游引物（10 pmol/L）各0.5μL，样品DNA为1μL，共计25μL。其中PCR反应程序为95℃预变性4 min；95℃变性1 min，62℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环；后72℃延伸5 min。反应结束后对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，后将PCR反应产物送到上海生物工程公司进行测序。

1.3 测序数据的处理与分析

将测序数据使用BioEdit 7.2.5软件进行分析比对，并对测序的数据进行校对，确保数据的准确性。采用DnaSP 5.10.01软件确定曲麻莱牦牛的多态位点、单倍型数量、单倍型多样度和核苷酸多样度，后采用MEGA 5.05软件中的邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统发育树，揭示曲麻莱牦牛的母系遗传背景。

2 结果与分析

2.1 曲麻莱牦牛mtDNA D-loop区遗传多样性分析

通过测定34头曲麻莱牦牛的D-loop序列，得到有效片段长度为618 bp，排除1处插入或缺失位点后，共发现多态位点36处（图1），占所分析序列长度的5.83%。在36处多态位点中有4处为单一多态位点，包括85、144、239、382位点，约占总序列长度的0.65%；其余的32处为简约多态位点，分别为35、42、60、67、98、113、119、146、173、174、175、181、182、192、201、218、221、234、235、236、240、242、244、251、254、259、281、316、317、323、426 和464 位点，约占总序列长度的5.18%。

研究结果表明:34头曲麻莱牦牛D-loop区序列分析共确定了20种单倍型，其中单倍型H1由6个个体共享，为优势单倍型。单倍体H7、H9和H12均由3个个体共享，而H3、H4和H17均由2个个体共享，剩余的所有单倍型均有1个个体所共享。单倍型多样度为0.952±0.020，核苷酸多样度为0.018±0.009，序列平均核苷酸差异K值为10.10。

2.2 曲麻莱牦牛系统发育分析

从Genbank中找出普通牛（AB085924）作为外群，对曲麻莱牦牛D-loop序列20种单倍型构建系统发育树（图2），结果显示:20 种单倍型聚为 2 个支系，其中 H6、H13、H7、H2、H9、H11、H18、H3、H10、H8、H1、H15 和 H17 为一支（即支系Ⅰ），H5、H12、H16、H4 和 H14 为另一支（即支系Ⅱ）。

3 讨论与结论

遗传多样性是生物进化与分化的基础，遗传多样性研究可为揭示物种的进化历史、迁徙和起源等研究提供洞察，同时可为其品种选育与改良奠定基础。在对野牦牛mtDNA D-loop区的研究中，Ma等［8］对8头野牦牛mtDNA D-loop区全序列进行测定分析，得出其单倍型多样度为0.962±0.026。Guo等［9］对13头野牦牛进行了母系遗传多样性分析，结果显示其单倍型多样度为0.960±0.040。Wang等［10］对47头野牦牛进行了D-loop区进行测序分析，得出其单倍型多样度为0.967±0.013。可以看出，野牦牛的单倍型多样度大小值为0.920～1.000。而在我国家牦牛的mtDNA D-loop区母系遗传研究中，赖松家等［11］基于mtDNA D-loop区的结果对5个群体（九龙、麦洼、天祝、西藏牦牛和及犏牛）进行了分析，研究结果表明这5个群体的平均单倍型多样度为0.970±0.018。郭松长等［12］对我国10个家牦牛群体（环湖、巴州、斯布、大通、嘉黎、九龙、青海高原、天祝牦牛、帕里和麦洼牦牛）的D-loop区作了测序分析，其平均单倍型多样度为0.925±0.010。李瑞哲等［13］对34头雪多牦牛的mtDNA D-loop区进行了研究，其单倍型多样度为0.900±0.043。涂世英等［14］对15头中甸牦牛D-loop区进行了测序分析，表明其单倍型多样度为0.983。Yue等［15］对209头天祝白牦牛进行了mtDNA D-loop区全序列测定，得出其单倍型多样度为0.946±0.007。宋乔乔等［16］对我国8个西藏牦牛类群共328头牦牛进行了mtDNA D-loop区序列测定与分析，其单倍型多样度为0.884。可以看出，我国家牦牛的单倍型多样度为0.884～0.983。在本研究中，曲麻莱牦牛的单倍型多样度为0.952±0.021，与上述基于D-loop区对野牦牛及其他家牦牛品种（群体）计算的单倍型多样度大小相比，其值也较高，这表明曲麻莱牦牛具有丰富的母系遗传多样性。究其原因，可能与曲麻莱牦牛生活在与野牦牛聚居区相毗邻的高原牧区有关。通常，在曲麻莱牦牛的繁殖季节，经常有毗邻地的野牦牛混入其群中交配，这种家、野牦牛间的杂交和遗传渐渗可一定程度上提高曲麻莱牦牛的遗传多样性。

在对曲麻莱牦牛的单倍型系统发育分析中，发现20种单倍型可以聚为2个支系，说明其具有2个母系起源，这与赖松家等［11］、郭松长等［12］、李瑞哲等［13］研究者对其他牦牛品种/群体的母系遗传研究结果一致。