一例大羚羊感染嗜水气单胞菌的诊断

刘真超

摘要 对2019年1月合肥野生动物园发生的一例大羚羊死亡病例，经临床观察、剖检病理变化以及实验室诊断相结合，确诊为嗜水气单胞菌感染。

关键词 大羚羊;嗜水气单胞菌;剖检;诊断

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydro？鄄phila）属于弧菌科（Vibrionaceae）气单胞菌属，为一种革兰氏阴性短杆菌，无芽孢与荚膜[1]。嗜水气单胞菌广泛存在于自然界的各种水体中，是多种水生动物的原发性致病菌，为条件致病菌，人或动物感染后常常出现腹泻、败血症等症状[2]。2019年1月合肥野生动物园有3只大羚羊（Tragelaphus oryx）出现死亡，死亡前未见明显临床症状。经临床观察、病理变化以及实验室诊断相结合，确诊为嗜水气单胞菌感染。现将该病例的诊断情况报告如下。

1材料与方法

1.1病料来源

合肥野生动物园病死大羚羊。

1.2主要试剂与引物

DL2000Marker、2×Taq PCR Master？鄄Mix、ddH2O均购自天根生化科技（北京）有限公司;药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司;16S rRNA上、下游引物分别为16S Forward（5'？鄄AGAGTTTGATCCTG？鄄GCTCAG？鄄3'）、16S Reverse（5'？鄄TACGGCTACC？鄄TTGTACGACTT？鄄3'），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3细菌分离与鉴定

1.3.1细菌分离与纯化无菌操作取病死羚羊肝脏、心包液、脾脏接种与兔血琼脂培养基上，37℃培养，24 h后挑取分别挑取单菌落接种于兔血琼脂培养基及辅酶培养基上，37℃条件下培养24 h。

1.3.2细菌染色镜检挑取单个菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察细菌形态。

1.3.3细菌DNA的提取挑取纯化后的单个菌落接种于TSB液体培养基中，于37℃，220 rpm条件下培养过夜，从菌液中提取细菌DNA。

1.3.4细菌16S rRNA的序列测定与鉴定分析以提取的细菌DNA样本作为PCR扩增反应的模板，利用细菌的16S rRNA引物进行扩增，PCR反应体系为20 μl，分别为2×Taq PCR MasterMix 10 μl，模板3 μl，上、下游引物各1 μl，ddH2O 5 μl。PCR扩增反应条件为95℃预变性5 min，95℃变性45 s，55℃退火1 min，72℃延伸1 min 30 s，共30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测鉴定后，将产物送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.3.5药敏试验采取纸片法，按照试剂盒说明书进行药敏试验。

2结果与分析

2.1剖检结果

剖检发现肺脏淤血（图1A），肝脏绿染（图1B），心包积液（图1C），此外还发现在羚羊的胃内有大量的塑料袋碎片（图1D）。

2.2细菌分离纯化与镜检结果

细菌经分离纯化培养后，菌落形态呈灰白色、圆形、边缘光滑且中央凸起，在兔血琼脂培养基上还可见明显的溶血环（图2）。挑取部分菌落涂片，经革兰氏染色后在光学显微镜下观察，发现为G-短杆菌（图3）。

2.3细菌的16S rRNA的PCR扩增结果

细菌16S rRNA的PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，可在约1 500 bp处见1条特异性条带，与预期条带大小相符（图4）

2.4测序结果与序列分析

将经测序得到的菌株的16S rRNA基因序列在NCBI上进行BLAST比对，结果显示与Aeromonas hydrophila GX6（嗜水气单胞菌GX6株，GeneBank登录号：KU937368.1）等嗜水气单胞菌的基因同源性达99%，结合以上检测结果，该病例可确诊为嗜水气单胞菌感染。PCR产物的测序结果如下：

2.5   药敏试验结果

药敏试验结果表明该株嗜水气单胞菌对加替沙星、环丙沙星、奈替米星、头孢哌酮、四环素、氯霉素、氟苯尼考、复方新诺明、呋喃唑酮、高度敏感;对丁胺卡那、庆大霉素、亚胺培南中度敏感;对克林霉素、林可霉素、氨苄西林、阿莫西林、罗红霉素耐药。

3讨论

嗜水气单胞菌广泛存在于自然界，尤其是淡水环境中，是一种典型的人-畜-鱼共患病原菌[3]。自DUSI JL[4]于1949年首次报道第一例蛙感染嗜水气单胞菌以及1966年Bulger RJ等[5]首次报道2例人感染嗜水气单胞菌起，国内外陆续报道过嗜水气单胞菌感染其他动物的报告，包括猪、鸡、长颈鹿、水貂、貉、狐、家兔、大熊猫、鸭、企鹅、黑鹳、噪鹛以及各种常见鱼类[6]。此外，嗜水气单胞菌还常与其他细菌发生混合感染。戚伟[7]等报道了一例某猪场仔猪大量死亡的病例，确诊为大肠杆菌与嗜水气单胞菌混合感染所致。该次病例中，在大羚羊的胃内发现大量残留的塑料袋碎片，因此可能造成羚羊进食、消化困难，机体免疫力下降，在饮用不卫生的水源后，进而感染嗜水气单胞菌。针对此次大羚羊感染嗜水气单胞菌，应结合药敏试验结果选取高敏药物用药，用药同时严密监控大羚羊的情况，发现不良反应及时查明原因，对症治疗。在饲养方面，应做好野生动物园动物卫生防疫工作，及时改善动物的饲养环境，并严格遵守饲养环境的消毒制度。

参考文献

[1] 胡安东，张明洋，张飘，等. 鲤源嗜水气单胞菌分离鉴定、耐药性及毒力基因检测[J]. 中国畜牧兽医，2019，46（7）：2167-2175.

[2] 杨守明，王民生. 嗜水气单胞菌及其对人的致病性[J]. 疾病控制杂志，2006（5）：511-514.

[3] 李巧玲，张召兴，吴同垒，等. 貉源嗜水气单胞菌的分离及其生物学特性鉴定[J]. 中国兽医学报，2018，38（9）：1740-1744.

[4] DUSI JL. The natural occurrence of redleg，Pseudomonas hydrophila，in a population of American toads，Bufo americanus[J]. Ohio J Sci.，1949，49（2）：70.

[5] Bulger RJ，Sherris JC. The clinical significance of Aeromonas hydrophila. Report of two cases[J]. Arch Intern Med.，1966，118（6）：562-564.

[6] 陳翠珍. 我国嗜水气单胞菌感染研究概况[J].河北科技师范学院学报，2012，26（4）：61-64.

[7] 戚伟，区海蕴，周亚兰，等. 猪大肠杆菌与嗜水气单胞杆菌混合感染病例的诊断及其体外抑菌试验[J]. 江西畜牧兽医杂志，2019（2）：10-14.

责任编辑：刘赟