基于代谢组学方法的两株酿酒酵母菌胞内差异代谢产物分析

欧科，陈福欣，王婷，冯光文，严贝贝，白巧秀，钱卫东，毛培宏*

1(新疆大学 物理科学与技术学院， 放射生态与离子束生物技术中心，新疆 乌鲁木齐，830046)2(西安科技大学 化学与化工学院，陕西 西安，710054)3(陕西科技大学 食品与生物工程学院，陕西 西安，710032)

1 材料与方法

1.1 菌株

酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)N6076来源于低能氮离子注入介导外源DNA随机转化酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Kh08获得的遗传稳定的产醌类物质的重组酵母菌，由新疆大学物理科学与技术学院放射生态与离子束生物技术中心保存。

1.2 培养基

YPD斜面培养基(g/L)：酵母膏10，蛋白胨20，葡萄糖20，琼脂粉10g。

液体培养基(g/L)：葡萄糖·H2O 80, 蛋白胨10，酵母膏粉5，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 0.5，pH自然。

1.3 实验方法

将YPD斜面培养基上培养48 h的新鲜菌种置于4 ℃保存24 h后接种至液体培养基中，置摇床150 r/min、28～30 ℃发酵96 h。分别于0、48和96 h收集菌液 5 mL于离心管内，3 000 r/min离心3 min，弃上清液，在菌体细胞中立即加入5mL淬灭液(V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=2∶2∶1)，充分混匀，-80 ℃冰箱内淬灭10 min。然后于4 ℃、10 000×g离心5 min，弃上清液。加入1 mL、-20 ℃的提取液(V(甲醇)∶V(氯仿)∶V(水)=2∶2∶1)，加等体积SiO2beads，加液氮反复冻融，最大速度涡振3次，使菌体细胞充分破碎。在进行胞内产物制备过程中，样本置于冰中，保证代谢产物的稳定。

将菌体破碎液，于4℃、10 000×g离心5 min，收集上清，N2常温吹干，复溶于0.5 mL、-20℃的萃取液(V(乙腈)∶V(水)=1∶1)，再于4 ℃、10 000×g离心5 min。收集上清，N2常温吹干，-80 ℃冻存。在进行UPLC-Q-TOF/MS和LC-MS/MS检测时，复溶于200 μL的溶液(V(乙腈)∶V(水)=7∶3)中即可。

本研究设置3个生物学重复，每个生物学重复的0、48、96 h的样品均设置6个技术重复。

1.4 色谱与质谱检测条件

UPLC-Q-TOF/MS(超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱仪，德国Bruker公司 Maxis plus)离子源：ESI; 检测模式：ESI+；毛细管电压：3 500 V，离子源温度：200 ℃；气体流速设定为8 L/min，雾化气体设置为4 bar。m/z扫描范围为50～2 000。数据采集速率设置为0.2 s，延迟0.1 s。色谱柱：C18(Waters BEH，50 mm × 2.1 mm，1.7 μm)；柱温：40 ℃；进样量：5 μL，流速：0.20 mL/min。流动相A(V(乙腈)∶V(水)=5∶95+0.1%甲酸，流动相B为纯乙腈+0.1%甲酸)。梯度洗脱：0～2 min(100%A)，2～24 min(100%～1%A)，24～28 min1%A)，28～29 min(1%～100%A)，29～30 min(100%A)。质量轴以甲酸钠为校准液，以确保准确度和重现性。

LC-MS/MS(高效液相色谱-质谱/质谱联用仪，Waters XEVO-TQD，美国Waters公司)的离子扫描模式为MRM扫描模式，正离子检测，母离子：229.235 8；子离子：131.340 0；锥孔电压：14 V；碰撞电压：8 V。色谱柱：C18 (Waters BEH，50 mm × 2.1 mm，1.7 μm)；柱温：40 ℃；进样量：5 μL，流速：0.20 mL/min。流动相A(水+0.1%的甲酸)，流动相B(乙腈+0.1%的甲酸)；梯度洗脱：0～1 min(100%A) 1～3.5 min(100%～1%A)，3.5～4.5 min(1%A)，4.5～4.9 min(1%～100%A)，5 min(100%A)。LC-MS/MS定量分析用的MVAP标准品购自Sigma-Aldrich公司，纯度>99%。

进入20世纪，由于人口和社会需求急速增加，以美国、前苏联、澳大利亚、巴基斯坦、印度及中国等为代表的国家，都通过跨流(区)域的调水来重新分配水资源，以缓解缺水地区经济发展的用水需求，促进社会经济发展，满足社会需求[28-29]。随着湖泊生态与环境问题的日益凸显，引水调控工程对受水湖泊的生态与环境效应也逐渐受到关注。

2 结果与分析

2.1 酵母菌胞内代谢物的UPLC-Q-TOF/MS定性分析

2株酵母菌不同发酵时间的胞内代谢物的UPLC-Q-TOF/MS检测数据用Data Analysis程序转换为CDF格式，进行XCMS-Online分析[7]，分析结果导入SIMCA-P，利用PLS-DA进行代谢物的鉴定。

分析结果表明，重组菌株N6076的PLS-DA模型中R2X=0.492，R2Y=0.999，Q2=0.745； 原始菌株Kh08的PLS-DA模型中，R2X=0.361，R2Y=0.999，Q2=0.605。2株酵母菌PLS-DA模型的R2Y与Q2均>0.5，说明PLS-DA模型能够较好的预测2个菌株的胞内代谢物的差异。PLS-DA模型的200次排序检验验证结果如图1所示，其回归线的斜率较大，且与纵坐标的截距小于零，说明模型质量较好，没有出现过于拟合的状况。

a-N6076;b-Kh08图1 重组酵母菌N6076与原始菌株Kh08的PLS-DA的模型置换检验图Fig.1 The PLS-DA model permutations test of metabolitesin recombinant yeast strain N6076 and original strain Kh08

在进行代谢物PLS-DA分析时，将每株菌0 h的代谢产物分为一组，48与96 h的分为一组。代谢物PLS-DA分布图(图2)显示，重组菌株N6076与其原始菌株Kh08的胞内代谢物的分离效果较好，每个菌株的48和96 h的代谢物与其0 h的有明显差异。重组菌株N6076的胞内代谢物，从第一主成分看，0 h组分布在负轴位置，48与96 h组主要分布正轴位置；从第二主成分看，0 h组主要分布在负轴上，48与96 h组分布于正负轴两侧。而原始菌株Kh08代谢物，从第一主成分看，0 h组的都分布在负轴上，48与96 h组分布在正轴上；从第二主成分看，0 h组主要集中在负轴，48与96 h组主要集中在正轴上。

a-N6076;b-Kh08图2 重组酵母菌N6076与其原始菌株Kh08的代谢物PLS-DA分布图Fig.2 Score plot of metabolites in recombinant yeast strain N6076 and original strain Kh08

选取VIP>1、P<0.05的代谢物差异点进行代谢物的PLS-DA载荷分析，结果显示了重组酵母菌N6076与其原始菌株Kh08代谢物的不同主成分的分布，距离中心越远的代谢物，其差异越大(图3)。2株酵母菌胞内代谢物在PLS-DA中的载荷均呈椭圆形分布，对差异贡献最大的点分别分布在第一主成分与第二主成分的正负轴两端(即椭圆的两端)。

a-N6076;b-Kh08图3 重组酵母菌N6076与其原始菌株Kh08的代谢物PLS-DA载荷图Fig.3 Loading plot of metabolites in recombinant yeast strain N6076 and original strain Kh08

2.2 酵母菌胞内代谢物的种类

UPLC-Q-TOF/MS测试结果(图4和图5)显示，重组菌株N6076的小分子代谢物的种类平均为88种，原始菌株Kh08的小分子代谢物平均为83种。重组菌株N6076的0与48 h的小分子代谢物的质荷比(m/z)大部分在170～850，96 h的小分子代谢物含有m/z>900的化合物。而原始菌株Kh08的48 h小分子代谢物就含有m/z>900的代谢产物。这说明，重组菌株中分子量>900的小分子代谢产物的生物合成时间较原始菌株延迟了48 h。对于重组菌株N6076中出现的质荷比为906.823 8、945.593 2、987.640 1的物质，尚没有相关报道，其性质有待进一步研究。

a-菌株N6076 48 h样本；b-菌株Kh08 48 h样本；c-菌株N6076 96 h样本；d-菌株Kh08 96 h样本图4 重组菌株N6076及其原始菌株Kh08胞内代谢产物的UPLC-Q-TOF/MS部分质谱图Fig.4 Partial UPLC-Q-TOF/MS Mass Spectrogram of intracellular metabolites of recombinant yeast strain N6076 and original strain Kh08

图5 重组菌株N6076及其原始菌株Kh08胞内代谢产物的UPLC-Q-Tof/MS色谱图Fig.5 UPLC-Q-Tof/MS chromatogram of intracellular metabolites of recombinant yeast strain N6076 and original strain Kh08

2.3 重组菌株N6076与原始菌株Kh08胞内代谢物的差异分析

将统计分析得到的重组菌株N6076与原始菌株Kh08胞内代谢物进行相互比较分析，获得了2株酵母菌株的差异代谢物，分别将其质谱信息与HMDB数据库进行比对，确定了酵母菌的胞内差异化合物，其中重组菌株N6076的差异化合物为11种(表1)，原始菌株Kh08的差异化合物为10种(表2)。

在2株酵母的胞内代谢差异物中，根据HMDB中的超级分类，重组菌株N6076代谢差异物中有7种脂类物质，原始菌株Kh08中有6种，在已鉴定出的差异物中占比很高。差异物丰度图(图6、图7)的结果显示，在重组菌株N6076中，脂类物质1-花生酰甘油三酯、4-O-methylmelleolide、β-谷甾醇乙酸酯、单甲基磷脂胺的浓度较高，且β-谷甾醇乙酸酯在各个样本中都是在96 h时浓度最高。在原始菌株Kh08已鉴定的差异物中，脂类物质 PG(25∶0)、β-谷甾醇乙酸酯、PE(22∶2/15∶0)浓度最高。

表1 重组菌株N6076中的差异化合物Table 1 The differential compounds in recombinant yeast strain N6076

表2 原始菌株Kh08中的差异化合物Table 2 The differential compounds in original strain Kh08

图6 重组菌株N6076中差异物的丰度图Fig.6 The abundance diagram of differential compounds in recombinant yeast strain N6076

图7 原始菌株Kh08中差异物的丰度图Fig.7 The abundance diagram of differential compounds in original strain Kh08

在重组菌株N6076的差异物中，差异倍数最大的是甲羟戊酸-5-磷酸。甲羟戊酸-5-磷酸(mevalonate-5-phosphate,MVAP)，又称甲戊酸-5-磷酸或5-磷酸甲戊酸，属于单烷基磷酸酯类化合物，为甲羟戊酸途径中重要的中间产物，是合成类异戊二烯、萜类和醌类物质的前体[8]。研究表明，MVAP为甲羟戊酸途径的重要中间产物，参与了细胞内许多酶促反应，是萜类和醌类等次生代谢产物合成的前体物质[9-12]。萜类化合物在食品中有重要的应用,可用作香精香料、甜味剂、营养强化剂等[13]。MVAP对重组菌株N6076的差异代谢物贡献最大，说明该菌株的甲羟戊酸代谢途径活跃，有利于次生代谢产物的合成。

在原始菌株Kh08的差异物中，差异倍数最大的是胱氨酸[14]。从KEGG数据库的胱氨酸代谢通路可知，其生物合成前体为S-腺苷-L-高半胱氨酸，而含有半胱氨酸的小分子肽具有较高的抗氧化活性[15]。在食品、药品中有抗氧化和防止非酶褐变作用, 常用作抗氧化剂或营养强化剂[16]。这暗示原始菌株Kh08的抗氧化能力优于重组菌株N6076。

2.4 MVAP的定量分析

利用LC-MS对MVAP进行定量测试，标准溶液的MVAP浓度梯度分别为50.0、25.0、12.5、10.0、5.0、1.0 μg/mL，拟合获得标准曲线为：y=1 669.72x-23 031.82；r=0.996 724，r2=0.993 458。

检测结果表明，重组菌株N6076发酵48h时，其胞内MVAP的质量浓度达到1.32 μg/mL，其MRM质谱图如图8所示，而原始菌株Kh08在相同发酵时间点时，其胞内MVAP未检出。对于这种情况的出现，到底是由甲羟戊酸途径中MVAP合成酶基因的改变造成的还是MVAP上游代谢相关基因调控的，还需进一步研究。

图8 重组菌株N6076发酵48 h胞内MVAP的MRM图谱Fig.8 MRM mapping of intracellular MVAP of recombinant strain N6076 fermented for 48 h

3 结论

UPLC-Q-TOF/MS的测试分析结果表明，重组菌株N6076代谢产物中分子质量>900的小分子化合物的合成时间较原始菌株Kh08延迟了48 h。

2株酵母菌胞内代谢物的相互比较分析结果显示，重组菌株N6076的差异化合物为11种，原始菌株Kh08的差异化合物为10种。这些差异代谢物中，脂类物质多，且丰度高，其中MVAP和胱氨酸分别是2株酵母菌最大的差异代谢物。

LC-MS测试结果，重组菌株N6076在48 h时，其胞内MVAP质量浓度达到1.32 μg/mL，而在原始菌株Kh08中未检出。

重组菌株N6076中脂类物质种类多于原始菌株Kh08，且浓度相对也高，而且存在合成萜类物质的MVAP，有利于次生代谢产物的合成[17]。原始菌株Kh08的代谢产物中存在胱氨酸，在抗氧化上更有优势[18]。