快速提升新型冠状病毒检测实验室生物安全防护水平的方法探讨

张宗兴，衣 颖，吴金辉，郝丽梅，张恩雷，张金明，祁建城

（军事科学院系统工程研究院卫勤保障技术研究所，国家生物防护装备工程技术研究中心，天津300161）

0 引言

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的传播途径主要以经呼吸道飞沫和接触传播为主，气溶胶和消化道等传播途径尚待明确[1]。根据目前掌握的SARS-CoV-2的生物学特点、流行病学特征、临床资料等信息，国家卫生健康委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎防控方案（第三版）》要求该病原体暂按照病原微生物危害程度分类中第二类病原微生物进行管理，未经培养的SARS-CoV-2 感染性材料在采用可靠的方法灭活前进行的相关检测操作等应在生物安全二级（bio-safety level 2，BSL-2）实验室中进行[2]。医疗机构病毒检测实验室生物安全防护水平普遍偏低，已成为医院开展疫情防控的短板。

鉴于SARS-CoV-2 比严重急性呼吸综合征（sever acute respiratory syndrome，SARS）冠状病毒和中东呼吸综合征（Middle East respiratory syndrome，MERS）冠状病毒更具传染性[3]，有必要采取相应措施有效提升检验实验室的生物安全防护水平，以降低人员感染风险和病原微生物泄漏风险。本文主要分析现有样本检测实验室开展SARS-CoV-2 样本检测存在的安全风险，提出可快速提升检测实验室生物安全防护水平的方案建议。

1 检测实验室存在的安全风险

目前，SARS-CoV-2 感染的常规检测方法主要是实时荧光逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR），医疗机构检验科室通常是根据《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》[4]要求建设PCR 检验实验室。全自动定量PCR 检验实验室通常设置3 个工作区：试剂贮存和准备区、标本制备区与核酸扩增检测区。因为检测过程中感染性材料在灭活前进行的所有相关检测操作都在标本制备区完成，所以标本制备区是唯一存在病原微生物暴露风险的区域。而标本制备区通常为普通BSL-2 实验室。以普通BSL-2 实验室作为标本制备区的PCR 检验实验室在开展SARS-CoV-2样本检验过程中存在的问题主要有以下3 个方面：

（1）为了避免交叉污染，PCR 检验实验室空气定向流动严格遵循单一方向原则，即试剂贮存和准备区→标本制备区→核酸扩增检测区，也就是说核酸扩增检测区的负压要低于标本制备区。鉴于SARSCoV-2 具有气溶胶传播的可能性，一旦气溶胶从生物安全柜内泄漏到BSL-2 实验室空间内，则在相邻房间压差作用下，气溶胶将有可能通过实验室围护结构缝隙泄漏至核酸扩增检测区。

（2）普通BSL-2 实验室并不要求采用全新风直流空调系统，因此部分实验室则在房间顶部设置自循环空调机或者壁挂式分体空调机。这种方式存在以下问题：①不符合定向气流的设置原则；②部分实验室的空调机出风口正对生物安全柜操作面，会干扰到生物安全柜工作窗口的气流流向，增加了病原微生物从生物安全柜内泄漏的风险。

（3）BSL-2 实验室要求若生物安全柜的排风在室内循环，则室内应具备通风换气的条件，可采用自然通风，也可采用机械通风。多数实验室采用自然通风，无法形成负压，且难以保证实验室定向气流；此外，部分实验室虽然采用了机械通风，且实验室处于负压状态，但是排风系统并未设置高效过滤器，当实验室内发生病原微生物泄漏后，病原微生物将直接排至室外，污染外环境。

2 提升检测实验室防护水平的主要措施

生物安全实验室主要通过各级防护屏障的设置保护内部操作人员和实验室外部环境，提升检测实验室生物安全防护水平的方法主要有2 个方面：（1）提升初级防护屏障防护水平，如个人防护装备、隔离操作设备等；（2）提升二级防护屏障防护水平，主要是改造实验室设施。

2.1 提升初级防护屏障防护水平

个人防护装备主要包括口罩、护目镜、防护面屏、手套、防护服、靴套、正压头罩、正压防护服等，其中正压防护服主要用于生物安全四级（bio-safety level 4，BSL-4）实验室。为保护检测人员安全，《新型冠状病毒感染的肺炎防控方案（第三版）》中要求在BSL-2 实验室开展样本检测操作时需采用BSL-3 实验室的个人防护措施，即佩戴N95 口罩或者动力送风过滤式呼吸器、护目镜或防护面屏、手套、医用一次性防护服，从而提升个人防护水平。为提高人员防护水平和舒适性，优先使用正压头罩等动力送风过滤式呼吸器。正压头罩可为人员头部、面部、呼吸道等提供全方位的防护，且经可靠消毒后可重复使用，是一种高等级的个体防护装备[5]。

BSL-2 实验室主要以Ⅱ级生物安全柜作为主要的隔离操作设备，依靠工作窗口向内的定向气流和排风高效过滤器，Ⅱ级生物安全柜可以有效地保护工作人员和周围环境。由于Ⅱ级生物安全柜的气流防护屏障易受到破坏从而导致防护失效，需严格遵守其使用要求。另外，Ⅱ级生物安全柜的正常使用离不开合适的工作环境（主要是无外界气流干扰），同时操作人员需要经过培训，熟悉其性能要求和防护原理，并严格按规范进行操作。但是Ⅱ级生物安全柜有开放的操作窗口，仅可提供有限保护，而Ⅲ级生物安全柜或手套箱式生物隔离器则是一种完全封闭的通风隔离设备，通过与之相连的橡胶手套来进行内部的操作，可以提供更高水平的安全防护。

2.2 提升二级防护屏障防护水平

实验室二级防护屏障是防止病毒泄漏到外环境的第二道防线。鉴于SARS-CoV-2 传播途径还未被完全掌握，为降低安全风险，未灭活病原的检测实验宜在加强型BSL-2 实验室中进行。相比普通BSL-2实验室，加强型BSL-2 实验室在功能区布局上需增设缓冲间，通风方式需要采用机械通风，核心工作间内送风口和排风口的布置符合定向气流的原则，可形成负压及压力梯度，排风经过高效过滤处理[6]，其核心工作间的安全防护水平几乎相当于BSL-3 实验室，可有效保护周围环境。

检测实验室的主要工作是开展感染性样本的检测，而主要高风险工作集中于在生物安全柜内开展的样本灭活前的相关操作，因此造成实验室内发生人员感染或病原微生物泄漏的潜在风险主要是病原微生物气溶胶从生物安全柜内泄漏。佩戴高等级个人防护装备可以有效保护操作人员，但并不能防止病原微生物扩散至外环境。在疫情防控压力居高不下的情况下，也不具备对实验室硬件设施进行快速改造以提升防护水平的条件。

世界卫生组织（World Health Organization，WHO）实验室生物安全手册指出，在常规的生物安全柜不能或不适合安装或维护的现场，可以采用柔性隔离装置来进行高危病原微生物的操作[7]。手套箱式生物隔离器防护原理依靠的是严格物理密封结构而非定向气流，其防护性能不易受外环境影响，可为操作人员和周围环境提供高水平的防护，因此，可适当降低操作人员个人防护等级，以改善操作人员工作的舒适度，减轻人员心理负担，减少误操作，提高安全水平；另外，感染物质完全受控，使污染区域最小化，适用于二级防护屏障水平较低的实验室。与Ⅲ级生物安全柜相比，柔性隔离装置具有成本低、工艺简单、生产周期短、安装方便的特点，适用于规模化应用。因此，使用柔性手套箱式生物隔离器替代Ⅱ级生物安全柜来提升初级防护屏障的防护水平将是最直接、最有效、最快捷的改造措施。

3 柔性手套箱式生物隔离器分类

根据防护原理分类，柔性手套箱式生物隔离器可分为常压型隔离器和负压型隔离器。常压柔性手套箱式生物隔离器不具备通风过滤及负压控制功能，采用物理阻隔原理，依靠完全密封的隔离器舱体、物品的气密传递等实现病原微生物与操作者和外环境隔离，但仅适用于操作经接触传播的病原微生物，而不能操作经空气传播的病原微生物。2014 年西非埃博拉疫情暴发期间，美国在塞拉利昂采用了常压柔性手套箱式隔离器（如图1 所示）开展埃博拉病毒样本检测工作，而且隔离器放置在采用自然通风的普通帐篷内使用，说明其应用可有效降低对实验设施高防护水平的依赖。

负压柔性手套箱式隔离器则是在常压柔性手套箱式隔离器的基础上，增加通风过滤系统和压差控制系统，即综合采用物理阻隔和空气动力学2 种隔离技术，将操作者与作业对象完全隔离，有效防止隔离器内病原微生物扩散至外环境，以保证工作人员的人身安全，并有效避免对实验场所自身以及周边的环境造成污染。英国研制了负压柔性手套箱式隔离器（如图2 所示）[8]，该隔离器配置有简单的通风过滤装置，可实现舱内负压，但其通风量不足，内部换气效率低，难以有效控制隔离器内负压，且不利于隔离器内空气中气溶胶浓度的稀释。

笔者单位研制了一款便携式负压柔性手套箱式生物隔离器[9]，由透明柔性隔离舱、轻质快接铝合金框架、送排风过滤系统、操作手套及气密传递窗组成（如图3 所示），可提供密封可靠的负压操作环境。如图4 所示，隔离器安装有1 道送风高效过滤器，而排风则采用2 道高效过滤器过滤，送、排风高效过滤器均可进行原位检漏确保过滤器的安全可靠，因此不必再将隔离器内空气排到建筑物外面，可直接安全排放到室内；同时，排风系统实时监测和调节隔离器内压差，维持稳定的负压，并在隔离器舱体发生薄膜破损、手套破损或脱落的意外情况下迅速增大排风，

以保证破损口向内的定向流，防止病原微生物外泄；手套口采用双凹槽设计，可实现破损手套操作中更换，而不破坏隔离器的密封结构；气密传递窗内安装有紫外灯，在物品传递时可对传递窗内空气和物品表面进行消毒；隔离器排风过滤装置配置有充电电

池，充满电情况下，可保证隔离器在无外接供电情况下持续运行时间不低于4 h。经第三方专业机构测试，

隔离器舱体在500 Pa 下，其空气小时泄漏率＜0.25%，高效过滤器过滤效率均≥99.99%@0.3 μm，负压值＞30 Pa，摘掉一只手套后，手套口风速＞1 m/s，换气次数＞30 次/h，满足RB/T 199—2015《实验室设备生物安全性能评价技术规范》[10]的要求，主要技术指标达到硬质三级隔离器的技术要求。

图2 英国研制的负压手套箱式隔离器[8]

图3 负压柔性手套箱式隔离器[9]

4 负压柔性手套箱式隔离器在新型冠状病毒样本检测中的应用方案

手套箱式隔离器是一种防护性能远高于Ⅱ级生物安全柜的隔离操作设备，但其应用也存在一个问题：由于大多数检测人员并未使用过手套箱式隔离器，初次使用手套进行隔离操作不够精准快捷，其工作效率明显低于Ⅱ级生物安全柜。为了不降低工作效率，同时提高操作的安全性，可以将手套箱式隔离器与Ⅱ级生物安全柜搭配使用。

图4 负压柔性手套箱式隔离器结构示意图

感染性材料在灭活前进行的所有相关检测操作是风险最高的。为此，将样本灭活前的操作全部在手套箱式隔离器内完成，具体包括采样管开盖、样本提取、加入裂解液。由于是在手套箱式隔离器内操作，样本可不通过56 ℃加热30 min 进行灭活，直接加裂解液进行灭活即可。上述操作完成后，对隔离器内空间喷洒消毒剂进行消毒，并将处理后的待检样本进行表面消毒装入密封袋，密封袋表面喷洒消毒剂后放入隔离器传递窗，使用紫外灯进行照射消毒。随后，将处理后的待检样本取出放入生物安全柜，开展样本核酸提取的后续操作。

为保证操作安全，需定期使用气体消毒设备对手套箱式隔离器进行气体熏蒸消毒，以便对残留的病原微生物进行彻底灭活。由于手套箱式隔离器为密封结构，可采用气体循环消毒方式对舱体、送风高效过滤器、第一级排风高效过滤器以及第二级排风高效过滤装置进行独立消毒，二级排风高效过滤装置的排风口与送风高效过滤器的进气口则作为气体消毒接口。具体消毒流程：首先，通过消毒管路将二级排风高效过滤装置的出气口与送风高效过滤器的进气口分别连接至消毒设备的进气口与排气口，使手套箱式隔离器与消毒设备构成气（汽）体消毒环路，如图5 所示；其次，开启气体消毒设备以对隔离器进行气体熏蒸消毒；最后，消毒结束后开启隔离器通风对残余消毒气体进行排放。

图5 手套箱式隔离器气体消毒原理图

5 结语

医疗机构开展SARS-CoV-2 检测的实验室普遍存在生物安全防护水平不高的问题，且由于样本检测工作量居高不下，特别是疫情重灾区，因工作负荷大、心理负担重等原因，检测人员始终处于较高的感染风险中。负压柔性手套箱式隔离器作为一种高防护等级的隔离操作设备，具有质量轻，可快速安装或折叠收纳、储运的特点，适用于疫情防控现场快速展开；同时，其应用也无需改变现有实验室硬件设施，且可与方舱、帐篷等临时搭建场所结合快速构建成病毒检测实验室，是一种可操作性强、实施难度低、可快速提升实验室的整体生物安全防护水平的有效措施。