铜对植物生长及叶组分的影响研究

王钰博，宋煕临，何 欣，徐逸北，杨丽丽，刘春玲

(沈阳理工大学 环境与化学工程学院，沈阳110159)

土壤中铜含量的正常范围为2～200mg/kg，平均值是22.6mg/kg。随着三废排放、矿业开采、含铜杀菌剂的使用等，土壤含铜量可能高出当地背景值的几倍到几十倍。土壤承载不了严重的重金属污染，动植物和微生物也会受到危害，更严重的是威胁到生态系统的稳定和人类的安全，因此，土壤中铜的污染引起了人们的广泛重视。

生态系统破坏的一个关键指示是植被的生长发育状况。植物在生长过程中，通过根部吸收地下的重金属元素并向地上茎、叶部位运输迁移和聚集。重金属对植物的毒害效应发生在当其在植物体内的积累超过毒性阈值时，此时由于植物根部受损等原因，致使植物对营养物质和必需微量元素的吸收困难，这些生命物质的缺乏导致植物生理代谢功能紊乱，从而出现叶内色素的组分和含量的变化、叶内细胞结构的变化、水分含量的变化、颜色的变化、叶面温度的变化、叶冠结构的变异等[1-6]。这些叶片特征的变化成为利用高光谱进行土壤环境质量监测的依据。

本文以大叶空心菜为供试植物，研究土壤中不同浓度铜对大叶空心菜生长高度、叶绿素及铜含量的影响，同时根据空心菜的生长高度和叶绿素含量的变化，研究土壤中铜对空心菜的毒性刺激阈值，并对叶中铜含量与叶绿素含量之间关系进行拟合分析，探索空心菜受铜影响的机理。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

(1)供试植物：大叶空心菜。

(2)供试土壤：取0～20cm的农田表层土搅拌均匀，然后经过自然风干、棍棒压碎翻动，拣除植物残体、碎石以及砂砾等杂物后，过100目筛。供试土壤的pH值为7.25，接近中性。供试土壤中主要重金属的含量如表1所示。

表1 土壤中多种重金属各自的含量 mg/kg

(3)供试试剂：采用硫酸铜溶液用于提供交换态的Cu2+，浸提剂为95%乙醇，消解采用浓硝酸和氢氟酸，均为优级纯或分析纯。土壤基肥选用无机氮磷钾。

(4)设备：超声波清洗仪，磁力搅拌器，火焰原子吸收分光光度计，干燥箱，721紫外-可见分光光度计，微波消解仪，玛瑙研钵等。

1.2 试验方法

植物细胞壁的主要成分包括大分子的纤维素、果胶和蛋白质，均含有负电基团，如羟基、羧基、醛基、氨基和磷酸基团等，因此细胞壁带有一定程度的负电性，能够吸收环境中的阳离子。由此本研究选用阳离子Cu2+作为供试重金属元素，且以硫酸铜溶液形式加入到土壤中。试验将硫酸铜溶液采用逐层喷洒、翻土混合的方式加入土壤中，充分混匀得到土壤中铜浓度(以Cu2+计)水平分别为0、100、200、400、600、800、1000、1500、2000mg/kg。每种浓度土壤加入无机氮磷钾基肥，施加浓度为：N 200mg/kg，P 80mg/kg，K 100mg/kg。土壤每天翻动混匀，平衡一周以上，栽种大叶空心菜；同时设置2～3组平行样。气温为23～36℃。植物培养期间，每天浇蒸馏水，生长36d后，进行叶绿素总量和叶片中铜含量等生化组分的测定。

1.3 组分的测定

(1)土样pH值的测定：玻璃电极法。采用土液比1∶2.5进行配比，取过20目风干土样10g(精确至0.01g)于小烧杯中，加入无CO2的超纯水25mL，用塑料膜封好烧杯，防止空气中CO2溶于水中，放在磁力搅拌器上搅拌30min，然后静置30min，测量前轻微摇动，用酸度计测量上清液的pH值。

(2)土壤和空心菜叶片中铜含量的测定：样品预处理后[7]，采用HNO3-HF湿法消解后再用火焰原子吸收分光光度法测定。称取约0.2g风干土壤样品于消解罐中，然后加入浓HNO38mL+HF 2mL，于近190℃高压微波消解约50min。180℃赶酸2h，赶尽白烟，蒸至近干，用1% HNO3溶液定容于100mL容量瓶中待测，同时制作试剂空白、过程空白、样品空白。

(3)叶绿素的浸提与测定：Arnon法。利用有机溶剂能溶解叶绿素的特性，将0.26～0.27g剪碎的叶片在有机溶液中研磨，然后加入95%乙醇在超声波仪器中黑暗浸提，再过滤定容至25mL，用紫外-可见分光光度计测定叶绿素提取液的光密度值(OD)，根据Lambert-Beer定律计算叶绿素含量。叶绿素的计算公式为

Ca=12.70A663-2.69A645

(1)

Cb=22.9A645-4.68A663

(2)

CT=Ca+Cb=20.21A645+8.02A663

(3)

式中：Ca为叶绿素a浓度，mg/L；Cb为叶绿素b浓度，mg/L；CT为叶绿素总浓度，mg/L；A663为试剂在波长663nm处的吸光度；A645为试剂在波长645nm处的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 空心菜株高

播种36d后，外源铜施加浓度(以Cu2+计)分别为0、100、200、400、600、800、1000、1500、2000mg/kg的土壤中空心菜的生长状况和生长高度分别如图1和图2所示。

由图1、图2可以看出，随着铜的增加，空心菜生长高度呈下降趋势，空心菜生长高度与土壤中铜的含量之间的相关系数达到-0.967。外源铜施加浓度为0～200mg/kg时空心菜的生长高度最高。其中，铜施加浓度为100mg/kg的土壤中空心菜的株高最大，为22.8cm；其次是无外源铜加入时；再次是外源铜施加浓度为200mg/kg时。

依据图2空心菜的生长高度，初步确定0～200mg/kg的外源铜施加浓度作为空心菜生长的铜毒性刺激阈值。位于铜毒性刺激阈值时，随着土壤铜浓度的增加，铜作为一种必需的微量元素有利于空心菜的生长，其生长高度有不同程度的增加。高于铜毒性阈值时，铜对空心菜生长的毒害效应越来越大。图2中铜毒害效应对生长高度的影响，表现在铜处理浓度为800mg/kg及以下的土壤中叶片浓绿，差别不大。随着供试元素铜含量的继续增加，根部越发受到损伤，植物开始散失水分调控能力，根部不能吸收足量的水分和所需的营养物质以供植株正常生长。吸水能力差导致植株出现各种病症，出现一定程度的脱水干枯，有的新叶皱缩卷曲，老叶出现枯萎发黄、叶面布有枯斑、光泽暗淡的症状。铜处理浓度为1000mg/kg时，此时植物生长发育迟缓，生物量严重降低。当土壤中铜增至1500～2000mg/kg时，空心菜外观健康状况很差，生长高度恒定在5.6cm，且保持幼苗期状态生长停滞，叶片部分萎黄、卷叶、落叶、叶小和出现死斑，甚至由于细胞膜结构遭到破坏而导致植物死亡。在生长高度方面，表现出明显的“低浓度铜促进、高浓度铜抑制”的规律[8]。

低浓度污染对于生物体可能具有刺激作用，即Hormesis效应(毒物兴奋效应)，就是化学物对生物体在高剂量时表现负面影响，生长、发育受抑，但在低剂量时却表现为有益作用的现象，刺激生长发育。通过实验数据的观察，空心菜在刺激阈值以下的低浓度铜含量时具有该效应；但随着铜的增加，铜在空心菜体内不断积累，使得Hormesis效应消失，铜对叶绿素的含量也造成了严重破坏，光合作用减弱，铜对空心菜生长的抑制效应显著增加。

2.2 不同铜添加浓度土壤中空心菜的铜含量

图2中，土壤的铜浓度不高于800mg/kg时，宏观观察认为空心菜生长近似正常，不同浓度间表现出的差异较小。叶绿素含量的变化一定程度上能够真正反映植物生长状况正常与否，因而测定空心菜叶片中的叶绿素及铜含量以考查不同浓度之间存在的差异性。图3为不同外源铜施加浓度土壤中空心菜叶绿素a、b及总量的变化。图4为土壤外源铜添加量对应的叶绿素a/b比值及叶中铜的含量。

从图3、图4可以看出，叶绿素a远高于b的含量，a受铜浓度的变化影响比较明显，随着土壤中铜含量的增加，a从1.47mg/g降低到0.35mg/g。b含量较低，且受铜影响的变化无明显规律，叶绿素b的实际含量很低，人为操作引起的误差也略大一些。叶绿素a、b最高浓度均出现在无外源铜施加时，此时土壤的总铜为54.01mg/kg。再依据空心菜的生长高度，最终确定将土壤总铜含量为54.01mg/kg作为空心菜生长的铜毒性刺激阈值。

叶绿素主要组分a的含量与叶中铜含量的相关系数为-0.558，叶中的铜含量越高，a的含量就越低，说明运输迁移到叶中的铜对光合色素细胞产生毒性，叶绿素的合成受到铜的明显抑制。a与土壤中铜含量的相关系数为-0.844，高于其与叶中铜的含量，表明叶绿素含量不只是受到叶中铜的抑制，与土壤中铜含量之间的关系更为密切。生物体作为一个复杂的有机体，叶绿素a的合成和分解受到多方面的作用。

图4中随着土壤中铜的增加，叶片中铜含量波动上升，叶绿素a/b值和叶绿素总量(a+b)整体呈下降趋势。

空心菜叶中叶绿素含量降低的原因很多，可能是原有的叶绿素受到破坏和分解加快，或叶绿素的合成受阻，从而出现叶片褪绿、黄化或花叶等症状。机理可能是铜与叶绿体中某种蛋白质结合或取代其中的Fe2+离子和Mg2+离子等，破坏了叶绿体的结构和功能，使叶绿素破坏和分解加剧。Webber M B等[9]认为是由于重金属抑制叶绿素酸酯还原酶和影响了氨基-γ-酮戊酸的合成，而这2个酶对于叶绿素的合成是必须的。空心菜受土壤中高浓度铜毒害(Cu2+离子浓度不低于1000mg/kg)，通过影响植物新陈代谢活动导致叶子感观上呈现失绿发黄并伴有褐斑的异常现象；叶绿素a与b的比值减小，光合系统I和II传递电子的能力降低，空心菜光合作用的速率下降[10]。究其原因，可能是空心菜体内的铜过量时，降低了空心菜一些生长有益的抗性酶(如抗坏血酸过氧化物酶)等的活性，却提高了能促进含氧自由基产生的酶(如过氧化氢酶的活性)。叶绿体的内膜因为膜脂的过氧化而导致结构被打乱，叶绿素的氧化分解加快，最终表现在宏观上失绿黄化。许多研究表明，植物叶绿素含量与多种抗病性密切相关。在逆境情况下，植物叶绿素含量降低，光合作用减弱，降低了植物的耐热性和越夏能力，不能为植物提供充分的营养保障，生长过程缓慢，削弱了植物抵御病害的能力。

图5为不同铜添加浓度土壤中空心菜根、茎、叶中铜的含量。根、茎、叶中铜含量与土壤的铜含量程度在0.01水平上显著正相关，相关系数分别为0.880、0.919、0.639。同一浓度下的铜含量比较，总是有：根>茎>叶。表明地下铜易于向空心菜地上部分运输。

2.3 叶绿素与叶铜含量之间的回归模型

对空心菜的叶铜含量(Cu)与叶绿素a(CHL a)含量、叶绿素总量(CHLa+b)、叶绿素含量a/b值、叶绿素b(CHLb)含量分别进行拟合分析，决定系数R2分别为0.729、0.621、0.461，叶绿素b含量与叶中铜含量之间没有找到合适的数学模型。比较得知a对叶中铜含量的反应最敏感，二者之间能建立多个效果良好的回归方程。

(1)复合函数

lnCu=ln(56.455)+ln(0.643)·CHL a

(2)增长函数

lnCu=4.033-0.441·CHL a

(3)指数函数

lnCu=ln(56.455)-0.441·CHL a

(4)逻辑函数

ln(1/Cu)=ln(0.018)+ln(1.554)·CHL a

所有回归模型的显著性水平p<0.05，相关系数R=-0.854，决定系数R2=0.729，表明叶绿素a与叶铜含量之间的拟合效果较好，叶绿素随叶铜增加而减少的原因，或是叶片中铜的积累对叶绿素细胞产生了毒性，使叶绿素的合成受到铜的明显抑制，或是原有的叶绿素因受铜破坏而分解速率加快。

3 结论

(1)空心菜表现出明显的“低浓度铜促进、高浓度铜抑制”的Hormesis效应。确定土壤铜对空心菜的毒性刺激阈值为54.01mg/kg。

(2)空心菜的生长高度在外加铜浓度为800mg/kg以内的土壤中差别不大；铜继续增加，空心菜根部受损，散失水分调控能力，无法吸收足量的水分和营养，出现各种病症，导致一定程度的脱水干枯和死亡。

(3)叶绿素a的含量与叶中铜含量的相关系数为-0.558，说明运输迁移到叶中的铜对光合色素细胞产生毒性，叶绿素的合成受到铜的明显抑制。a与土壤中铜含量的相关系数为-0.844，高于其与叶中铜含量的相关系数，表明叶绿素含量不只是受到叶中铜的抑制，与土壤中铜含量之间的关系更为密切。

(4)根、茎、叶中铜含量与土壤铜含量的相关系数分别为0.880、0.919、0.639。同一浓度下的铜含量比较，总是根>茎>叶，表明地下铜易于向空心菜地上部分运输。