辛伐他汀对SCID鼠增生性瘢痕模型的抑制作用研究

陈俊伟 李帆 杨艳清

[摘要]目的：建立重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠增生性瘢痕模型，并观察辛伐他汀乳膏外用对瘢痕的抑制作用。方法：取4周龄SCID小鼠12只，将手术切除的人类瘢痕组织皮片移植到其背部，1周后将小鼠随机分为3组，分别为模型组、乳膏基质组和1%辛伐他汀乳膏组，连续外用药物2周后，取各组移植瘢痕组织行HE染色、Masson染色;碱水解-分光光度法检测瘢痕组织中羟脯氨酸（HPr）含量。结果：植皮后1周，鼠背可观察到黄褐色、隆起于皮面、质地柔韧的类瘢痕组织，组织病理学可见排列紊乱的粗大胶原束，呈结节状或漩涡状排列，符合增生性瘢痕的特点。外用1%辛伐他汀乳膏2周后，真皮纤维化程度较模型组有所缓解，胶原含量减少，差异具有统计学意义（P<0.01）。结论：SCID鼠增生性瘢痕模型类似于人类增生性瘢痕，1%辛伐他汀乳膏可抑制该动物模型瘢痕组织增生。

[关键词]辛伐他汀;SCID小鼠;增生性瘢痕;纤维化

[中图分类号]R619+.6    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2020）01-0055-03

Inhibitory Effect of Simvastatin on Hypertrophic Scar Model of SCID Mice

CHEN Jun-wei，LI Fan，YANG Yan-qing

（Department of Plastic Surgery，the Third Hospital of Wuhan，Tongren Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，Hubei，China）

Abstract： Objective  To investigate the inhibitory effect of simvastatin cream on established hypertrophic scar model of severe combined immunodeficiency （SCID） mice. Methods  Human split-thickness skin grafts of hypertrophic scar were transplanted onto the dorsum of 12 four weeks old SCID mice. After one week， the mice were randomly divided into 3 groups： model control group， vehicle only group and 1% simvastatin cream group. After two consecutive weeks of treatment， the hypertrophic scar xenografts were harvested and given biopsy for histology by HE and Masson staining. Besides， alkaline hydrolysis-spectrophotometry was used to determine the level of hydroxyproline in hypertrophic scar xenografts. Results  After one week of transplantation， the xenografts showed characteristic human hypertrophic scar including a yellowish brown， firm and elevated appearance. Histopathology showed disordered thick collagen fibrils arranged in nodular or whirlpool shape. After two weeks treatment of 1% simvastatin cream， the dermal fibrosis was alleviated and collagen content was decreased compared with model control group， the difference was statistically significant（P<0.01）. Conclusion  The hypertrophic scar model of SCID mice is similar to that of human hypertrophic scar and 1% simvastatin cream could inhibit the scar development in this animal model.

Key words： simvastatin; SCID mice; hypertrophic scar; fibrosis

人體皮肤组织损伤后过度修复可发生增生性瘢痕（Hypertrophic scar，HS），由于其具体的分子生物学机制尚不清楚，目前临床中并无特异性根治方法。近些年来常用的方法有手术、激光、药物局部注射和放射治疗等，但是存在治疗周期长、复发率高和个体差异大等问题，且选择单一的治疗方法通常无法达到满意的效果[1]。因此，迫切需要开发一种新型的治疗药物，单独使用或与当前的治疗手段相结合，从而在对患者损伤最小的前提下，达到最佳的治疗效果。

辛伐他汀（Simvastatin）是一种羟甲基戊二酰基辅酶A（HMG-ConA）还原酶抑制剂，用于治疗高胆固醇血症，近来有报道辛伐他汀可减少兔耳增生性瘢痕的形成[2]。体外实验发现辛伐他汀可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖并促进其凋亡[3]。重症联合免疫缺陷小鼠（Severe combined immunodeficiency mouse， SCID小鼠）是一种纯合子基因突变鼠，其细胞免疫和体液免疫功能均有缺陷，可作为人类皮肤移植的理想受体[4]。本次通过构建SCID小鼠增生性瘢痕模型，验证该模型的可行性，并进一步探讨辛伐他汀治疗的可能性与分子机制。

1  材料和方法

1.1 主要试剂：辛伐他汀原药粉购于美国Calbiochem公司（CAS号：79902-63-9），1%辛伐他汀乳膏和乳膏基质由武汉大学同仁医院药剂科自制，Masson染色试剂盒购于福州迈新公司，羟脯氨酸试剂盒购买于南京建成生物工程研究所。4周龄雌性SCID Beige小鼠（质量合格证编号：11400700230963）购买自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于武汉大学人民医院动物实验中心SPF级实验室。

1.2 模型制备、动物分组和药物处理：参照文献[5-7]报告的方法构建动物模型。移植人类瘢痕组织来源于武汉大学同仁医院整形科瘢痕畸形整复术中切除的皮肤组织。术中征得患者知情同意，本研究通过武汉大学同仁医院医学伦理委员会批准。将切取的瘢痕组织尽量去除皮下脂肪，修剪为1cm×1.5cm的长方形皮片，生理盐水纱布包裹，快速低温送至动物房备用移植。SCID小鼠随机分为3组，模型组（皮片移植）、乳膏基质组（皮片移植+外擦乳膏基质）、1%辛伐他汀组（皮片移植+外擦辛伐他汀乳膏），每组4只。给予SCID小鼠七氟醚吸入麻醉，对其背部进行脱毛，消毒后剪开至筋膜層，使用可吸收缝线将备用皮片缝合，边缘仔细对合，术后将小鼠分笼饲养。造模1周后，乳膏基质组与辛伐他汀组分别外用乳膏基质与1%辛伐他汀乳膏，每日2次，连用2周。

1.3 组织学病理检查：外用药物2周后处死小鼠，将背部移植瘢痕组织连带周围部分正常鼠皮一同取下。经过4%多聚甲醛固定后24h，石蜡包埋并制备5μm厚的切片，之后分别进行HE染色及Masson染色。正置显微镜下观察并摄取图片。主要观察以下指标：①瘢痕组织形态;②胶原形态及排列。每张切片随机选取3个200倍放大的视野，使用Olympus机载显微图像数字化分析软件测量各个组的真皮厚度。

1.4 瘢痕组织羟脯氨酸（HPr）含量测定：动物组织中HPr的测定可用来反映皮肤总胶原的含量。参照试剂盒的说明书，使用NaOH将组织中HPr多肽水解为游离的HPr，经过氧化反应可生成红色的吡咯化合物。约50g瘢痕组织经过匀浆、消化和水解等步骤，取上清后于分光光度计550nm处测量各管的吸光度值。皮肤总胶原含量（mg/g）=HPr（mg/g）/12.5%。

1.5 统计学分析：采用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析，所有计量资料使用均数±标准差（x?±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，处理组与模型组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2  结果

2.1 增生性瘢痕模型观察：植皮后1周，移植瘢痕皮片组织与小鼠周围正常皮肤基本对接，颜色为蜡黄色，质地柔软，周围可见灰褐色边界（见图1）。

2.2 HE染色结果：模型建造成功后开始用药，2周后取组织行HE染色。从HE染色结果中可见，瘢痕组织与周围鼠皮几乎完全连接。因小鼠表皮与真皮较薄，真皮下可见脂肪组织，有明显毛囊结构，组织学结果中可清晰分界小鼠皮肤与人类瘢痕组织。模型组瘢痕组织真皮内可见大量胶原纤维束，排列致密、紊乱、红染，呈漩涡状或结节状，符合增生性瘢痕的组织病理学表现。乳膏基质组较模型组无明显差异。1%辛伐他汀组与模型组相比胶原纤维有所减少，染色强度减弱（见图2）。

2.3 Masson染色结果：Masson染色可更加清晰显示真皮层纤维化程度。模型组与乳膏基质组染色结果显示，真皮层可见大量致密深染的粗大胶原纤维，1%辛伐他汀组着色程度有所下降，纤维化程度降低，胶原纤维含量有所减少，染色强度减弱（见图3）。

2.4 真皮厚度及皮肤总胶原含量测定：通过测定羟脯氨酸的含量可反映皮肤总胶原的含量。治疗2周后，乳膏基质组与模型组相比，总胶原含量及真皮厚度无明显改变（P>0.05）。1%辛伐他汀组与模型组相比，总胶原含量明显减少（P<0.01），但两组间真皮厚度比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

3  讨论

皮肤作为人体最大的器官构成防御外界刺激的第一道屏障，当皮肤受到深达真皮层的创伤后，成纤维细胞过度增殖并产生大量细胞外基质可形成增生性瘢痕，由于其发生的具体分子机制尚无定论，目前暂无令人满意的预防或治疗策略。合适的动物模型对于疾病的科学研究至关重要，不仅为探索其病理发展过程提供基础，更可在一定程度上缩短新药的研发进程。由于不同种系的特异性，实验动物的普通创面愈合过程通常较快且无明显瘢痕形成。中国学者李荟元等于1998年首先建立了兔耳增生性瘢痕模型，并观察了不同形状和深度的创面对此模型中瘢痕组织胶原含量、组织病理及蛋白表达等指标的影响，对后期国内学者研究增生性瘢痕模型具有开创性的意义[8-9]。该兔耳模型组织病理主要为成纤维细胞增殖及胶原沉积，类似人体增生性瘢痕。由于兔耳与人体皮肤组织结构存在差异，有学者观察到兔耳软骨组织受创与该模型有一定关联，这种改变与人体增生性瘢痕的形成存在差别[10-12]。在本实验尝试将人类瘢痕组织皮片移植至SCID小鼠背部，并验证该增生性瘢痕动物模型的可行性。SCID小鼠由于细胞免疫和体液免疫均存在缺陷，对异物的排斥反应明显降低，可作为人体组织移植的理想受体[4]。研究表明，SCID小鼠与目前国内应用较多的裸鼠相比，前者更适宜建立肿瘤移植动物模型，移植成功率高于后者[13-14]。本次观察了人类皮肤增生性瘢痕组织移植到SCID小鼠背部后，瘢痕组织的存活情况并行组织学活检，结果表明，术后1周，移植皮肤瘢痕组织质地柔软，颜色有所加深，边缘呈灰褐色且轻度高出皮面。术后3周取皮损行组织病理学观察，可见人体皮肤组织与周围鼠皮紧密连接，且符合增生性瘢痕的胶原分布特点，进一步证实了该小鼠瘢痕模型的可行性。然而，本实验中观察到，SCID小鼠背部移植的瘢痕组织在3周后开始萎缩消退，周围正常鼠皮逐渐向移植区扩大并最终将其完全替代，这与增生性瘢痕组织在人类皮肤上长期存在且数年无消退不相符，考虑与瘢痕组织所处的微环境发生改变有关，且SCID小鼠免疫系统缺陷影响了瘢痕组织的发展演变过程，后期拟通过将瘢痕组织皮下埋植或皮肤牵张器干预等方法改善此动物模型，以期延长移植瘢痕组织的存活时间。

在创伤愈合过程中，促进或抑制纤维化的细胞因子相应地表达增高或者减低，正常的胶原合成与降解稳态被破坏，大量胶原合成并堆积于真皮层，形成了增生性瘢痕的基本病理改变[15]。其中转化生长因子β1（TGF-β1）是瘢痕形成中的关键效应因子，在瘢痕的增殖期其受体表达明显增强，信号通路被激活引起细胞外基质大量分泌[16]。目前临床上已证实有效的药物有激素类、钙离子拮抗剂、抗肿瘤药物等[17]。此外，有研究表明，辛伐他汀可阻断TGF-β1/Smad2，3信号通路，抑制成纤维细胞Ⅰ型胶原的产生[18]。低氧条件下，辛伐他汀还可抑制瘢痕组织成纤维细胞增殖并促进其凋亡[19]。此外，有学者通过机械损伤在兔耳廓部构建增生性瘢痕，观察到局部瘢痕内注射他汀类药物可抑制兔耳瘢痕组织发展[20]。本次将人类瘢痕组织植入SCID小鼠背部建立增生性瘢痕模型，观察外用辛伐他汀对该模型的影响。Masson染色结果表明，经1%辛伐他汀乳膏局部治疗2周后，瘢痕组织的纤维化程度和范围与模型组相比明显减小。此外，真皮厚度也有所变薄。羟脯氨酸作为胶原合成的特有原料，含量恒定，其数值可反应皮肤的总胶原含量。实验发现辛伐他汀外用2周后，皮肤总胶原含量显著低于模型组，表明辛伐他汀通过抑制胶原沉积可起到治疗瘢痕的作用。

综上所述，将瘢痕组织移植到SCID小鼠背部可模拟人类增生性瘢痕，为研究增生性瘢痕的发展演变过程及筛选治疗手段提供科研基础。辛伐他汀通过调节真皮纤维化、影响真皮层厚度及抑制胶原合成发挥治疗瘢痕的作用。然而，本研究中建立的动物模型瘢痕组织存活时期较短，仍需进一步改善。目前，辛伐他汀对瘢痕的体内治疗作用均局限于动物模型，仍需严格的药物临床试验来验证其有效性和安全性。

[参考文献]

[1]中国整形美容协会瘢痕医学分会常务委员会专家组.中国瘢痕疙瘩临床治疗推荐指南[J].中国美容整形外科杂志，2018，29（5）：前插1-12.

[2]Ko JH，Kim PS，Zhao Y，et al.HMG-CoA reductase inhibitors （statins） reduce hypertrophic scar formation in a rabbit ear wounding model[J].Plast Reconstr Surg，2012129（2）：252e-261e.

[3]陳斌，康春福，于东宁，等.辛伐他汀对不同病理条件刺激的瘢痕疙瘩成纤维细胞功能的影响[J].中华整形外科杂志，2016，32（2）：130-135.

[4]Pearson T，Greiner DL，Shultz LD.Humanized SCID mouse models for      biomedical research[J].Curr Top Microbiol Immunol，2008，324：25-51.

[5]Kundu-Raychaudhuri S，Datta-Mitra A，Abria CJ，et al.Severe combined immunodeficiency mouse-psoriatic human skin xenograft model： a modern tool connecting bench to bedside[J].Indian J Dermatol Venereol Leprol，2014，80（3）：204-213.

[6]Qiu SS，Dotor J，Hontanilla B.Effect of P144? （anti-TGF-β） in an “in vivo” human hypertrophic scar model in nude mice[J].PLoS One，2015，10（12）：e0144489.

[7]钱进，邓辰亮，杨松，等.建立SCID鼠增生性瘢痕模型的实验研究[J].组织工程与重建外科杂志，2018，14（1）：31-35.

[8]李芸元.增生性瘢痕动物实验模型应用最新动态[J].中国美容医学，2013，22（13）：1455-1461.

[9]罗亮，赵炫仲，李昕珊，等.人参皂苷Rb1注射对兔耳增生性瘢痕中PCNA表达的影响[J].中国美容医学，2016，25（11）：65-67.

[10]李荟元，刘建波，兰海.建立增生性瘢痕动物实验模型[J].第四军医大学学报，1998，19（6）：655-657.

[11]李希军，柳大烈，王吉慧.兔耳增生性瘢痕模型建立方法的探讨[J].中国美容医学，2006，15（5）：499-500.

[12]Kloeters O，Tandara A，Mustoe TA.Hypertrophic scar model in the rabbit ear： a reproducible model for studying scar tissue behavior with new observations on silicone gel sheeting for scar reduction[J].Wound Repair Regen，2007，15 Suppl 1： S40-S45.

[13]Suarez CD，Littlepage LE.Patient-derived tumor xenograft models of breast cancer [J].Methods Mol Biol，2016，1406：211-223.

[14]时彦胜，耿志贤，战大伟，等.SCID小鼠和BALB/c裸鼠对两株人体肿瘤细胞系移植敏感性的研究[J].中国实验动物学杂志，2000，10（1）：5-10.

[15]Lee HJ，Jang YJ.Recent understandings of biology， prophylaxis and treatment strategies for hypertrophic scars and keloids[J].Int J Mol Sci，2018，19（3）：E711.

[16]Lanning DA，Diegelmann RF，Yager DR，et al.Myofibroblast induction with transforming growth factor-beta 1 and -beta3 in cutaneous fetal excisional wounds [J].J Pediatr Surg，2000，35（2）：183-187.

[17]劉伟源，许贤君，陈燕图.增生性瘢痕的生物学基础及药物应用的研究进展[J].中国美容医学，2018，27（8）：151-154.

[18]Mun JH，Kim YM，Kim BS，et al.Simvastatin inhibits transforming growth factor-β1-induced expression of type I collagen， CTGF， and α-SMA in keloid fibroblasts[J].Wound Repair Regen，2014，22（1）：125-133.

[19]姚建，苏开新，王海华，等.低氧条件下辛伐他汀对瘢痕疙瘩成纤维细胞功能的影响[J].中国美容医学，2017，26（12）：52-55.

[20]Jia S，Xie P，Hong SJ，et al.Local application of statins significantly reduced hypertrophic scarring in a rabbit ear model[J].Plast Reconstr Surg Glob Open，2017，5（6）：e1294.

[收稿日期]2019-07-22

本文引用格式：陈俊伟，李帆，杨艳清.辛伐他汀对SCID鼠增生性瘢痕模型的抑制作用研究[J].中国美容医学，2020，29（1）：55-58.