鬼灯擎中岩白菜素超声提取纯化工艺的优化

雷燕妮,张小斌,李多伟，甘全明

(1.商洛学院 生物医药与食品工程学院,陕西 商洛 726000；2.商洛学院 健康管理学院,陕西 商洛 726000；3.西北大学 生命科学与医学部，陕西 西安 710069;4.陕西富士金医药保健品有限责任公司，陕西 西安 710075)

鬼灯檠又名七叶鬼灯檠，别名老蛇盘、秤杆七等，其是一种草本植物，属虎耳草科，本品在我国秦巴山区广泛分布，为民间常用草药，其根茎是更为常用的药材部分，主要功效为清热解毒，除此之外还能止泻、止血等。对菌痢、子宫脱垂、老年慢性支气管炎等疾病都有较好的疗效[1～3]。最近几年，对其的研究更进一步，普遍发现其含有的岩白菜素(Bergenin)是关键成分，这也是其能够发挥抑菌和抗病毒的主要原因，而且在鬼灯檠中含量较高。笔者通过单因素实验和正交实验，筛选出一个更加优化、甚至最优的最优工艺条件来超声提取鬼灯檠中岩白菜素,同时通过实验为其的提取纯化的工业化生产提供科学的实验数据。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

鬼灯擎，岩白菜素(批号1532-200202)分别为陕西略阳县华瑞杜仲开发有限责任公司和中国药品生物制品检定所所生产，其中前者通过了西北大学生命科学与医学部李智选研究员鉴定。甲醇等化学试剂均为国产分析纯，水为重蒸水。

1.2 实验仪器

U3000高效液相色谱仪；ME235S-电子分析天平；RE-2000 A旋转蒸发器；H·H·S21-6C电热恒温水浴锅；101A-2型鼓风干燥箱；SB-4200DT超声清洗器；SHB-C循环水式多用真空泵；LD5-10高速离心机；FZ102植物粉碎机。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 高效液相色谱法测定岩白菜素的含量[4、5]色谱条件 色谱柱: Kromasil-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相:甲醇-水(25∶75)，检测波长:275 nm，流速:1.0 mL·min-1，柱温:(30±1)。

标准溶液的配制:取岩白菜素对照品，通过电子分析平精准称取10.0 mg样品，选取规格为50 mL容量瓶，向其中加入称好的样品，然后向容量瓶内倒入适量的甲醇，使两者混合，溶解，最终充分均匀溶液得浓度为0.20 mg·mL-1对照品溶液。

标准曲线的绘制:对制作好的对照品溶液进行吸取，吸取量依次为5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 μL，然后注入高效液相色谱仪中，按照上述的色谱条件的标准，准确计算并记录高效液相色谱图和峰面积。结果表明岩白菜素其进样量(X,μg)与峰面积(Y)之间存在线性关系，线性范围0.1～5.0 μg。

2.1.2 鬼灯擎中岩白菜素提取溶剂及提取方法的比较 取鬼灯擎粉末，精确称取4份，各10.00 g，按1∶15料液比分别加入95%乙醇、75%乙醇、55%乙醇和水4种不同浓度的乙醇溶剂，浸泡1.0 h，然后在85℃水浴中热回流提取2.0 h或超声(20 kHz)提取1.0 h，过滤，用相应浓度的乙醇溶剂将滤液定容至250 mL，最后对白菜素的浓度进行检测，采取方式是高效液相色谱法，计算含量。

2.1.3 鬼灯擎中岩白菜素提取率各单因素的影响 取鬼灯擎粉末准确称取10.00 g，选取规格为250 mL的烧瓶，将称取的粉末倒入其中，然后将95%乙醇混与其中，在不同的提取时间、不同的料液比、不同的提取次数、不同的提取温度下进行超声提取，过滤，滤液定容至250mL，用高效液相色谱法测定溶液中岩白菜素的浓度，计算含量。确定在不同提取条件下提取因素的变化范围，以及各因素的最佳参数。

2.1.4 乙醇浓度在鬼灯擎中岩白菜素提取纯化中的影响 取鬼灯擎粉末，精确称取100.00 g，3份，分别按1∶10料液比浸泡于95%乙醇、75%乙醇和55%乙醇3种不同浓度的乙醇溶剂中1.0 h，然后超声(20 kHz)提取，其时间为45 min，总共提取两次，然后对其进行过滤操作，获得滤液后进行减压浓缩使其没有醇味，放凉，用稀酸碱调pH，析晶，离心得析晶物，烘干测定得率，最后检测其中的岩白菜素的含量。

2.1.5 鬼灯擎中岩白菜素提取率的正交试验 由上述单因素实验可知鬼灯擎中岩白菜素醇超声提取法优于醇热回流提取法，参考乙醇浓度在鬼灯擎中岩白菜素提取纯化中的影响实验结果，故确定鬼灯擎中岩白菜素采用95%乙醇超声提取法。采用L9(34)设计正交试验，研究超声提取时间、料液比、超声提取次数和超声提取温度对岩白菜素提取的影响，寻找最佳提取参数。

2.2 结果与分析

2.2.1 提取溶剂及提取方法的比较 岩白菜素的浓度的检测，计算含量所得结果见表1。表1显示，在热回流法中，对鬼灯擎中岩白菜素的提取能力为95%乙醇>75%乙醇>55%乙醇>水；在超声法中，对鬼灯擎中岩白菜素提取能力为95%乙醇>75%乙醇>55%乙醇>水；超声法提取能力高于热回流法；尤其是用75%、95%乙醇提取效果最佳，故本实验确定采用75%、95%乙醇超声提取法进行鬼灯擎中岩白菜素的提取。

2.2.2 鬼灯擎中岩白菜素提取率各单因素的影响 鬼灯擎中岩白菜素提取率各单因素的影响见表2。

表1 鬼灯擎中岩白菜素不同溶剂浓度不同提取方法提取效果的比较

表2 各单因素对鬼灯擎中岩白菜素提取率的影响

表2表明，岩白菜素醇超声提取率随醇超声提取时间的延长而增加，45 min后岩白菜素超声提取率增加缓慢，同时生产成本也会随着时间的增加而增加，故超声提取时间应控制在45～60 min为宜；岩白菜素醇超声提取率随醇超声提取料液比的增加而增高，超过1∶10料液比后，岩白菜素醇超声提取率随超声提取料液比的增加幅度变小。超声提取料液比的增加会大大增加溶剂用量，造成生产成本的增加，故超声提取料液比确定在1∶10为宜；岩白菜素醇超声提取率提取2、3、4次的效果都好，但提取2次的效果与提取3次、4次的提取率效果增加不明显，超声提取次数增加会延长生产周期及溶剂的用量，会大大增加生产成本，故超声提取次数确定在2次为宜；岩白菜素醇超声提取率随超声提取温度的增加提取率增加缓慢，在55℃后超声提取率几乎明显变化，提取温度的增加会增加生产成本，也会降低超声提取设备的寿命，故超声提取温度以控制在45～55℃为宜。

2.2.3 乙醇浓度在鬼灯擎中岩白菜素提取纯化中的影响 表3显示95%乙醇提取液含量与75%乙醇提取液含量相差不大，析晶物含量相差也不大，但析晶物得率相差很大，前者的转化率高出后者的42.49%，说明在鬼灯擎岩白菜素提取纯化中乙醇浓度是影响析晶物得率的关键，故在醇超声提取中应该采用95%乙醇进行岩白菜素的提取纯化，而不能采用75%乙醇或以下浓度的乙醇进行岩白菜素的提取纯化。

2.2.4 鬼灯擎中岩白菜素提取率的正交试验 用同样的方法检测岩白菜素的浓度，计算含量，鬼灯擎中岩白菜素提取率正交试验结果见表4，直观分析和方差分析的结果分别于表5和表6。

表3 乙醇浓度在鬼灯擎中岩白菜素提取纯化中的影响

从直观分析表5看出，A因素极差最大，B因素, D因素, C因素次之，表明对鬼灯擎中岩白菜素提取率影响最大的为A因素，其次为B因素、D因素、C因素。从方差分析表6看出，A因素F>F0.01，具有显著意义，B因素F0.05>F>F0.1，有较显著意义, C因素和D因素F0.1> F，无显著性意义。根据各因素k的变化率得出：A因素选2水平, B因素选2水平, C因素选3水平, D因素选3水平,即鬼灯擎中岩白菜素醇超声醇提的条件为A2B2C3D3。

表4 正交表L9(34)及结果

表5 鬼灯擎中岩白菜素提取率直观分析结果

表6 鬼灯擎中岩白菜素提取率方差分析结果

3 讨论

通过单因素试验、纯化实验及正交试验对鬼灯擎中岩白菜素醇超声提取工艺进行优化实验比较,综合各实验结果，确定鬼灯擎中岩白菜素醇超声提取最佳工艺参数为选择在45℃实验温度下，以1∶10料液比的比例，在45 min之内，用95%的乙醇对其进行超声提取1到2次。因此醇超声提取法更加具有优势，尤其是在时间、溶剂方面，并且其操作的方式也更加方便。

超声提取在科技人员的努力下，1～20 t·d-1投料规模的超声提取工业化生产设备已在生产中推广使用，因此，不断完善超声提取工艺是非常重要的。笔者实验的研究结果经过了科学的论证，有着可靠地的根据促进鬼灯擎的产业化开发利用，可供工业规模化生产借鉴。