微载体培养ST细胞制备猪细小病毒灭活苗及其免疫原性分析

2020-03-16

兽医导刊 2020年5期

猪细小病毒（PPV）可引起猪繁殖障碍性疾病，易引起木乃伊胎、流产、死胎、新生仔猪死亡等疾病。近年来，猪细小病毒病在欧美国家的发病率急剧增加，在我国，该病的发病率也出现上升趋势，多地开始流行该病，且发病范围在不断扩大。同时猪细小病毒对环境抵抗力强，可存活数月之久，难以完全消除。该病目前尚无有效的治疗方法，主要还是通过接种疫苗来预防该疾病的发生，目前国内猪细小病毒疫苗以灭活苗为主。

本实验使用微载体培养ST细胞大规模制备猪细小病毒，进一步制备灭活疫苗并检测其免疫原性，为后期灭活疫苗的开发奠定基础。

1 材料和方法

1.1 细胞及毒株ST细胞和猪细小病毒由哈药疫苗有限公司研发中心提供。

1.2 主要试剂微载体Cytodex-1购自美国GE公司；培养基MEM购自美国Gibco公司；新生牛血清购自美国Clark公司；二乙烯亚胺购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 试验动物2～4日乳鼠，体重350～400g，豚鼠购自中医药大学。

1.4 微载体培养ST细胞规模化培养制备猪细小病毒在7L生物反应器中加入3g/L微载体高压灭菌后，按细胞接种密度2.0×105/mL接种ST细胞悬液至生物反应器中。设置培养参数为pH7.2、温度为37℃、溶氧50%，搅拌速度为90r/min。每隔24h无菌取样观察细胞，结晶紫对细胞进行消化计数。待细胞爬球率为90%左右时排除培养液，清洗微载体细胞2次，按MOI为0.02接种猪细小病毒种毒同时将病毒维持液压入反应器中。每隔24h无菌取样观察细胞，结晶紫对细胞进行消化计数。培养4d，当80%以上的细胞病变后，冻融细胞2次，除去微载体。

1.5 病毒含量测定将病毒液用MEM细胞培养液作10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7三个稀释度，各加入96孔细胞培养板，每个稀释度6孔，每孔100µL，同设6孔加100µL MEM作为无病毒空白对照。每孔加入100µL新消化的ST细胞悬液（4.0×105个/mL），置37℃含5%CO2培养箱中培养5d，每日观察和记录各孔中病毒感染情况，取最高细胞病变时间点，按Reed-Muench法，计算病毒的致半数细胞感染滴度（TCID50）。

1.6 病毒灭活将病毒液缓慢加入2%的二乙烯亚胺（BEI）溶液，充分混匀，使其最终浓度为0.02%。30℃灭活72h。将50%硫代硫酸钠溶液加入灭活病毒液中，使其终浓度为2%，中止灭活。将灭活的病毒液接种ST细胞，观察细胞病变情况。

1.7 病毒纯化将病毒液用0.45µm的中空纤维柱去除细胞碎片，用100KD中空纤维柱对猪细小病毒做20倍浓缩，然后按不低于原液量1/2体积的PBS液重悬。

1.8 灭活疫苗制备取法国赛比克公司MontanideTMISA 206 VG佐剂为油相，将纯化的病毒液作为水相，油相与水相体积比为1∶1，循环搅拌至油相与水相充分混合，乳化成双相油乳剂。

1.8 灭活疫苗制备及免疫原性检测

1.8.1 灭活疫苗制备取法国赛比克公司MontanideTMISA 206 VG佐剂为油相，将纯化的病毒液作为水相，油相与水相体积比为1∶1，循环搅拌至油相与水相充分混合，乳化成双相油乳剂。

1.8.2 免疫原性检测体重350g～400g、猪细小病毒HI抗体阴性豚鼠10只，随机分为2组，免疫组各肌肉注射猪细小病毒灭活疫苗0.5mL/只，免疫后28d后，连同条件相同的未免疫对照豚鼠5只采血，分离血清，采用0.5%豚鼠红细胞凝集抑制试验，确定血清中和抗体效价。

2 结果

2.1 微载体培养ST细胞规模化培养制备猪细小病毒将ST细胞接种至生物反应器后，定时取样观察细胞贴壁以及其在微载体上的生长情况，结果如图1。ST细胞在微载体Cytodex-1表面生长状态良好，24h时取样观察到ST细胞均完成贴壁并呈长梭形贴附在微载体上，开始进行细胞増殖生长。细胞生长72h时，细胞爬球率达到90%以上，细胞密度约为1.5×106cells/ml。细胞生长72h时，接种猪细小病毒，接毒后48h可以看到细胞皱缩、变圆，先附着于微载体表面，后破碎脱落，在接毒后72h，绝大部分细胞破碎脱落，停止病毒培养，收获病毒液。经测定，收获后病毒液病毒滴度为8.14logTCID50/mL。