高效液相色谱法同时测定牙痛药水中丁香酚和胡椒碱含量*

黄 华，许莺婷，胡卫南，余小平

（浙江省衢州市食品药品检验研究院，浙江 衢州 324002）

牙痛药水收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂（第二册）》（标准编号为WS3-B-2009-90），由荜茇、高良姜、细辛、丁香、冰片组方，前3 味药经60%乙醇加热回流提取，丁香用乙醇提取，合并后加甘油混合，加冰片混匀，有止痛、杀菌、防蛀作用，主要用于风火牙痛、牙龈红肿、虫蛀牙痛及一切神经牙痛。荜茇为方中君药，含胡椒碱，丁香中含丁香酚，为本制剂的有效成分，原标准中只测定乙醇量，有效成分测定均未涉及。液相法分别测定牙痛药水中胡椒碱含量已有报道，但通过中国知网查询，同时测定丁香酚和胡椒碱含量国内目前未见报道。本研究中查阅文献[1-11]，建立了同时测定丁香酚和胡椒碱含量的高效液相色谱（HPLC）法。现报道如下。

图1 高效液相色谱图

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司），包括真空脱气机（G1322A），四元泵（G1311A），自动进样器（G1329A），柱温箱（G1316A），二极管阵列检测 器 （DAD）（G1315D），Agilent 色谱工作站（Rev.B.03.02 January，2008）；Mettler AE 240 型电子天平（梅特勒公司，精密度为0.01 mg）；KQ-250B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，250 W，40 kHz）；UV2450 型紫外分光光度计（日本岛津公司）。

1.2 试药

甲醇为分析纯；水为纯化水；丁香酚对照品（批号110725-201615，含量为99.3%），胡椒碱对照品（批号110775-201104，含量为99.2%），均由中国食品药品检定研究院提供；牙痛药水[市购3 批，规格均为每瓶5 mL（批号为170802，成都迪康制药有限公司；批号为170501，广西慧宝源制药有限公司；批号为G17034，包头中药有限责任公司）]；高良姜、细辛、冰片本地市购，经我院宋剑锋主任中药师鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Sunfire- C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇-水（72∶28，V/ V）；流速：1.0mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL；检测器：DAD 检测器；检测波长：280 nm。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：分别取丁香酚对照品25 mg、胡椒碱对照品12 mg，精密称定，置同一50 mL 容量瓶中，加甲醇超声溶解并定容，摇匀，作为对照品贮备液。精密量取5 mL，置同一25 mL 容量瓶中，甲醇至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

供试品溶液：取本品5 支，混匀，精密量取2 mL，置25 mL 容量瓶中，加甲醇适量，超声处理10 min，冷至室温，在加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm 的微孔滤膜滤过，即得。

阴性对照品溶液：按其质量标准中处方比例、制法制备不含荜茇、丁香的阴性样品溶液，按供试品溶液制备方法制得。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：取上述3 种溶液，按拟订色谱条件，分别进样5 μL，记录色谱图，见图1。可见，丁香酚的保留时间（t）为3.5 min，胡椒碱的保留时间（t）为5.4 min，阴性对照品溶液在丁香酚、胡椒碱出峰时间区域无干扰峰出现，故对丁香酚、胡椒碱的测定无干扰作用。理论板数以丁香酚计可达8 000 以上，样品中丁香酚、胡椒碱与相邻色谱峰的分离度满足测定要求。

线性关系考察：分别精密量取对照品贮备液1.0，3.0，5.0，7.0，9.0，11.0 mL，分别置20 mL 容量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，注入液相色谱仪，记录色谱图。以丁香酚、胡椒碱质量浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程Y丁=5.007X+2.721 9，r=0.999 6（n=6）和Y胡=12.858X+7.101 4，r=1.000 0（n=6）。结果表明，丁香酚和胡椒碱质量浓度在25.4 ～279.8 μg/mL 和12.5 ～137.8 μg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取同一混合对照品溶液，重复进样5次，以峰面积和保留时间考察进样精密度。结果丁香酚、胡椒碱的峰面积值基本不变，RSD分别为1.45%和0.12%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密量取同一供试品溶液，按拟订色谱条件，分别于0，2，4，6，8，20，24 h 时进样测定。结果丁香酚、胡椒碱峰面积的RSD分别为0.73%和1.06%（n=7），表明供试品溶液在常温下24 h 内稳定。

重复性试验：取样品（批号为170802），分别按2.2项下方法制备6 份供试品溶液和混合对照品溶液，分别精密量取5 μL 注入液相色谱仪，以外标法分别计算含量。结果丁香酚、胡椒碱平均含量分别为1.439 mg/mL和0.632 mg/mL，RSD分别为0.69%和0.84%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取阴性样品溶液9 份，每份2 mL，分别置25 mL 容量瓶中，再分别精密加入对照品贮备液4.0，5.0，6.0 mL 各3 份，按2.2 项下方法制备供试液品和对照品溶液，分别进样，记录峰面积，按外标法计算丁香酚、胡椒碱的回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（ n=9）

2.4 样品含量测定

按2.2 项下方法制备供试品溶液和对照品溶液，按

拟订色谱条件各精密量取5 μL 注入液相色谱仪，记录峰面积，按外标法计算含量。结果见表2。

表2 样品含量测定（n=3）

3 讨论

3.1 测定指标确定[1]

牙痛水中荜茇为君药，荜茇被收载在2015 年版《中国药典（一部）》，含量测定指标为胡椒碱；处方中丁香也为2015 年版《中国药典（一部）》收载品种，含量测定指标为丁香酚，故本研究中将胡椒碱和丁香酚确定为牙痛水中含量测定指标。

3.2 测定波长选择

紫外最大吸收波长丁香酚为280 nm，胡椒碱为343 nm，丁香酚在343 nm 波长处几乎无吸收，胡椒碱在280 nm 波长处有吸收。综合考虑，选择280 nm 作为测定波长。

3.3 流动相选择

本研究中选用不同比例的甲醇水作为流动相，水比例提高，主峰出峰推迟，胡椒碱峰变宽，对称度变差。最终选择甲醇-水（72 ∶28，V/ V）为测定条件，此条件下阴性对照品溶液在丁香酚、胡椒碱出峰时间区域无干扰峰出现，对结果影响较小。水相pH 调高调低，对主峰出峰时间无影响。

3.4 样品测定浓度确定

样品浓度以2 mL 稀释至25 mL 较合理，浓度太高杂质对测定有干扰，易造成含量偏高。