反相高效液相色谱法同时测定瓜蒌宽肠胶囊中厚朴酚、阿魏酸和延胡索乙素含量*

高 珊，彭丽艳，尹树旺，于桂兰，王春艳

（河北省唐山市妇幼保健院药剂科，河北 唐山 063000）

瓜蒌宽肠胶囊是我院自制制剂（冀药制字Z20051575），由瓜蒌、厚朴、延胡索、川芎、当归、莱菔子、大黄等10 味药材经提取、浓缩等工艺加工制成的复方中药制剂，具有宽肠理气、除胀止痛的功效，临床常用于治疗气血失调、腑气不通所致的腹胀痛、便秘恶心及腹部手术后腹胀痛患者。方中川芎具有活血行气、祛风止痛等功效[1-4]，延胡索具有活血、行气、止痛等功效[5-8]，厚朴具有燥湿消痰、下气除满等功效[9-12]。瓜蒌宽肠胶囊虽已广泛用于我院治疗术后腹部胀痛患者，但原质量标准中无含量测定项。有关厚朴酚、阿魏酸和延胡索乙素的含量测定方法已有较多报道[13-19]，但同时测定的方法目前尚未见报道。为有效控制瓜蒌宽肠胶囊的制剂质量，本研究中建立了同时检测瓜蒌宽肠胶囊中厚朴酚、阿魏酸和延胡索乙素3 种活性成分的反相高效液相色谱（RP-HPLC）法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-20AD 型高效液相色谱仪，配备LC-20AT 泵、SL-20A 自动进样器、SPD-20A 紫外可见光检测器、岛津LC solution 色谱工作站，UV-2501PC 型紫外可见分光光度计，Shim-pack VP-ODS C18液相色谱柱，均购自日本岛津公司；BP211D 型电子分析天平（德国赛多利斯公司，精度为十万分之一）；DL -360A型超声波清洗器（上海之信仪器公司）；Milli-Q integral 5 型超纯水系统（美国密理博公司）。

1.2 试药

阿魏酸对照品（批号为110773-201614，含量以99.0% 计），延胡索乙素对照品（批号为110726-201819，含量以99.8% 计），厚朴酚对照品（批号为110729-201714，含量以100.0%计），均购自中国食品药品检定研究院；瓜蒌宽肠胶囊（唐山市妇幼保健院制剂室制备，批号分别为180717，180905，181016，规格为每粒0.5 g）；乙腈、甲醇为HPLC 级（美国Tedia 公司）；水为超纯水（自制）；磷酸为分析纯（国药集团化学试剂厂）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色 谱 柱：Shim -pack VP -ODS C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；检测波长：297 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：25 μL；流动相：乙腈（A）-0.3%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0 ～7 min 时18%A，7 ～29 min时18%A ～74%A，29 ～30min 时74%A ～18%A，30 ～35min时18%A）。

2.2 溶液制备

对照品溶液：取阿魏酸对照品25.25 mg、延胡索乙素对照品25.05 mg、厚朴酚对照品25.0 mg，精密称定，置25 mL 容量瓶中，加95%甲醇溶解定容至刻度，摇匀，即得对照品贮备溶液（阿魏酸、延胡索乙素和厚朴酚质量浓度均为1.0 mg/mL）。精密量取对照品贮备溶液1.0 mL，置100 mL 容量瓶中，加95%甲醇定容至刻度，摇匀，即得。阿魏酸、延胡索乙素和厚朴酚质量浓度均为

10.0 μg/mL）。

供试品溶液：取样品20 粒，倒出内容物，取约1.0 g，精密称定，置25 mL 容量瓶中，加95%甲醇约15 mL，超声提取约25 min（超声功率150 W，频率70 Hz），放冷，加95%甲醇定容至刻度，摇匀，0.45 μm 滤膜过滤，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按瓜蒌宽肠胶囊制备方法和药材配比比例，制备缺川芎、延胡索和厚朴的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备，即得。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别取2.2 项下3 种溶液，按拟订色谱条件，稳定后分别进样分析，记录色谱图。结果阴性对照无干扰峰，表明方法专属性良好。色谱图见图1。

线性关系考察：取2.2 项下对照品贮备溶液，精密量取适量，制成阿魏酸、延胡索乙素和厚朴酚质量浓度分别为0.4，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 μg/mL 的标准曲线溶液，加95%甲醇定容至刻度，摇匀，按拟订色谱条件，稳定后分别进样分析，记录色谱图；以质量浓度（X）为横坐标、待测成分峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线。结果见表1。

表1 线性关系考察结果（ n=6）

图1 高效液相色谱图

检测限和定量限考察：取2.2 项下对照品溶液，逐级稀释，按拟订色谱条件，稳定后分别连续进样6 次，记录色谱图。以信噪比（S/N） =3 ∶1 时计算检测限，以S/N=10 ∶1 时计算定量限。结果阿魏酸、延胡索乙素和厚朴酚的检测限分别为0.08，0.11，0.06 μg/mL，定量限分别为0.22，0.32，0.18 μg/mL。

稳定性试验：取同一批（批号为180717）供试品溶液，室温下放置，按拟订色谱条件分别于0，2，4，6，12，24 h 时进样分析。结果阿魏酸、延胡索乙素和厚朴酚的峰面积的RSD分别为1.0%，1.4%，1.1% （n=6），表明供试品溶液在24 h 内稳定。

重复性试验：取同一批（批号为180717）样品，依法制备6 份供试品溶液，按拟订色谱条件，稳定后分别进样分析，记录色谱图。结果阿魏酸、延胡索乙素和厚朴酚含量的RSD分别为3.2%，4.1%，1.9% （n=6），表明方法重复性良好。

精密度试验：取2.2 项下同一对照品溶液，按拟订色谱条件，稳定后进样分析，连续进样6 次，记录色谱图。结果阿魏酸、延胡索乙素和厚朴酚峰面积的RSD分别为1.3%，1.1%，0.8%（n=6），表明仪器精密度良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为180717）20 粒，倒出内容物，取约1.0 g，精密称定，置25 mL 容量瓶中，共称取6 份；分别加入一定量2.2 项下对照品贮备溶液，后续按供试品溶液进行处理，得样品加标溶液6 份。按拟订色谱条件在溶液稳定后分别进样分析，记录色谱图，计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）

2.4 样品含量测定

取3 批样品（批号为180717，180905，181016），依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件在溶液稳定后分别进样分析，记录色谱图，根据峰面积计算含量。结果见表3。

表3 样品含量测定结果（mg/g）

3 讨论

3.1 检测方法选择

中药成方制剂中常用的活性成分检测方法有滴定法、紫外可见分光光度法和液相色谱法。前两者需要对待测物质进行提纯，否则易受到其他成分的干扰，方法专属性较差，检测结果准确度偏低。HPLC 法采用色谱柱进行分离，依据外标法进行定量检测，专属性强，检测结果准确度高。3 种待测成分阿魏酸、延胡索乙素和厚朴酚均具有较强的紫外吸收，故选择液相色谱法最适宜。

3.2 检测波长选择

取阿魏酸对照品10 mg，精密称定，置100 mL 容量瓶中，加95%甲醇溶解定容至刻度，精密移取1.0 mL上述溶液，置10 mL 容量瓶中，加95%甲醇定容至刻度，摇匀，得阿魏酸检查溶液；同法配制延胡索乙素和厚朴酚检查溶液。上述溶液在190 ～400 nm 波长范围内进行光谱扫描，结果阿魏酸、延胡索乙素和厚朴酚最大吸收波长分别在319，280，293 nm 附近。为使3 种待测物具有良好的响应，最终确定检测波长为297 nm。试验证明，选择297 nm 作为检测波长时，3 种待测成分响应良好，定量结果准确。

3.3 流动相选择

分别考察甲醇-水、甲醇-0.3%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.3%磷酸水溶液作为流动相体系，保持拟订色谱条件不变，对对照品溶液和供试品溶液进行洗脱，考察3 种待测物分离效果和分离时间。结果采用甲醇-水和甲醇-0.3%磷酸水溶液体系时，厚朴酚保留时间较久，检测效率偏低；采用乙腈-水体系时，厚朴酚出现峰分叉现象；采用乙腈-0.3%磷酸水溶液体系时，3 种待测成分分离效果良好，峰形尖锐，定性定量结果准确。故选择乙腈-0.3%磷酸水溶液作为流动相体系。

3.4 提取方法优化

试验中分别选择甲醇、95%甲醇、75%甲醇和50%甲醇作为提取溶液，对样品中阿魏酸、延胡索乙素和厚朴酚的提取效果进行了比较。结果以95%甲醇作为提取溶剂时，阿魏酸、延胡索乙素和厚朴酚的提取效果最佳，最终确定采用95%甲醇作为提取溶剂。