电针大肠俞募穴对功能性腹泻大鼠肠道褪黑素、5-HT水平的调控研究

王静，罗丹妮，李修娟，张微，郑倩华*，李瑛

（1.成都中医药大学针灸推拿学院，四川 成都；2.四川省中西医结合医院继续教育部，四川 成都；3.成都中医药大学研究生院，四川 成都）

0 引言

功能性腹泻（Functional Diarrhea，FD）是常见的消化系统疾病，以是排便次数增多，粪便性状改变为主要临床症状[1]。腹泻症状，体现了肠道动力亢进。流行病学研究表明，FD在我国的发病率是1.54%[2]，美国成年人FD发病率为2.1%[3]。腹泻症状的长期存在不仅可以引起其他的并发症，也严重影响了患者的生活质量[4]。

研究表明，针灸治疗胃肠道疾病效果显著，针灸可减少患者排便次数、改善大便性状，提高患者生活质量[5-7]。长期的临床实践及大量基础研究均证实针灸治疗FD的疗效性和安全性[8]。古今大量文献指出大肠俞募配穴是针灸临床治疗胃肠道疾病的常用配穴方法之一，针灸通过俞募穴对异常的肠道动力进行良性调节，令肠道动力回归正常，从而令机体恢复内在平衡的稳态，起到治疗作用。在对针灸治疗腹泻的选穴规律进行分析后亦可以看出俞募配穴法正是临床治疗FD的常用配穴方法[9]。近年来，在国家“973计划”项目研究中也发现针刺大肠俞募穴可减少腹泻次数，缓解腹泻相关临床症状[10]。

研究发现，肠道的嗜铬细胞（Entcrochromaffin cells，EC）合成、分泌的褪黑素（Melatonin，MT）与肠道动力密切相关，其水平高低与肠道动力方向有密切关系。在体及体外实验证实，小剂量MT可促进肠道动力，但大剂量则抑制肠道动力。目前，MT作用于肠道动力的机制尚不清，可能与同为EC合成、分泌及储存的肠道5-羟色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）及其信号系统功能有关。本研究以FD模型大鼠为研究对象，研究电针大肠俞募穴对FD大鼠肠道MT、5-HT水平的调控及对5-HT信号系统的影响，拟进一步阐释电针调整FD大鼠异常肠道动力的生物学机制。

1 材料和方法

1.1 动物及分组

SPF级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，由成都达硕实验动物有限公司提供（动物生产许可证号：0018541），共30只，体重250-300克。使用普通级动物饲料饲养，饲养期间大鼠自由饮水与进食，光照周期12h:12h。大鼠购回后于动物实验室进行为期一周的适应性饲养，随后以SPSS软件生成随机号，将大鼠按照体重随机分为以下3组：空白对照组（空白组）、功能性腹泻模型组（模型组）、电针大肠俞募穴腹泻组（电针组），每组10只。

1.2 实验仪器及试剂

1.2.1 主要试剂

浓度为0.3g/mL的番泻叶（购于成都中医药大学附属医院门诊中药房），生理盐水（成都科伦药业有限公司），7%水合氯醛(成都科龙化工试剂公司，生产日期：20140427)，酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒：12.8ng/mL标准品（上海酶联生物科技有限公司，货号：mL302829）；标准品稀释液（上海酶联生物科技有限公司，货号：mL302829）；酶标包被板（上海酶联生物科技有限公司，货号：mL302829）。

1.2.2 主要仪器

旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂，RE-52AA）,恒温水浴箱(上海市北仪器厂，TO-1-75)，台式封闭电炉（天津泰斯特仪器有限公司，DL-1-15）,优普超纯水制造系统（成都超纯水有限公司，UPH-II-10T），一次性不锈钢灸针（规格：0.25×13mm，苏州华佗医疗器械厂），韩式电针仪（LH202H，北京力普康医药科技发展公司），电子天平（上海精密科学仪器有限公司，F-1000）。

1.3 功能性腹泻大鼠模型的建立

参照相关文献的方法[11]，模型组、电针组大鼠均采用以下方法建立FD模型。取番泻叶360g，清洗浸泡30分钟后，配6倍的清水（2160mL）进行加热，沸腾后，继续再煎煮10分钟，纱布过滤，浓缩水煎液至1200mL（0.3g/mL）。分装为10袋，置于-18℃冰箱保存。用时采取水浴加温到28℃，均按10mL/kg剂量对模型组、电针组大鼠进行灌胃，每日1次，连续灌胃10天，期间大鼠可自由饮水与进食。评估造模前后大鼠的粪便性状，包括24h总便粒数、稀便数、稀便率、稀便级、腹泻指数，以判断腹泻模型制备成功与否。空白组大鼠每日同一时间行相应的抓握，并使用28℃的生理盐水按10mL/kg剂量灌胃，期间自由饮水与进食。

1.4 干预方法

1.4.1 穴位选择与定位

选取电针大肠俞募穴，即大肠俞和天枢穴进行电针治疗。穴位定位标准参照《实验针灸学》以及结合动物比较解剖学方法定位进行取穴治疗[12]。大肠俞，在腰部，当第四腰椎棘突下，旁开约5mm。天枢，在腹部，脐中旁开约5mm。

1.4.2 干预操作

在造模开始第一天，进行番泻叶水煎剂灌胃1小时后，即进行针灸治疗，连续干预10天。采用自制鼠架固定大鼠后，充分暴露其腰腹部，剪去穴位所在部位毛发。皮肤经75%医用酒精消毒后，以1寸针灸针刺入腧穴约5mm，采用平补平泻手法捻转行针1min后，接韩式电针仪，波形选择疏密波，频率为2/15Hz，电流强度为1.5mA，以大鼠肢体轻微抖动为度，留针20min，1次/日，连续治疗10次。电针操作要求为每次治疗时分别取同侧俞募穴，于两穴接电针正负极。左右俞募穴交替使用。空白组、模型组大鼠每日以相同方法抓握以及固定相同时间，但不接受任何治疗。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 一般情况观察

于造模开始至治疗结束，每天固定时间对所有组别的大鼠进行精神状态、皮毛色泽及活动度进行观察。并测量每日体质量。

1.5.2 粪便性状评估

于造模开始至治疗结束，每天固定时间对大鼠的粪便性状、气味进行观察，并于造模前、治疗结束后，进行24h总便粒数、稀便粒数、稀便率、稀便级和腹泻指数的计算：在以上各时间点对腹泻模型组和电针大肠俞募穴腹泻组进行本项目检测。稀便率=大鼠的稀便粒数/大便的总粒数（稀便以滤纸上有无污迹为标），稀便级（根据滤纸上污迹范围的大小分为4级：1级，污迹直径＜1cm；2级，污迹直径1-2cm，3级，污迹直径2-3cm；4级：污迹直径＞3cm）和腹泻指数=稀便率×稀便级。

1.5.3 肠道MT、5-HT水平的检测

治疗结束后当天，禁食不禁水12h后，处死各组大鼠，开腹后快速取出回肠、近端结肠及远端结肠（距肛门0.5cm），详细标记组别及部位后,进行以下项目的检测。

（1）肠道MT水平测定：将上述不同部位组织切碎后用生理盐水稀释10倍彻底匀浆，取匀浆上清液50μl，采用ELISA法检测肠道组织中MT水平。

（2）肠道5-HT水平测定：按照以上（1）中所述方法分别对不同肠道组织进行采样及处理，采用ELISA法检测肠道5-HT水平。

1.6 数据分析

连续变量数据以均数±标准差表示，采用SPSS 19.0统计软件包进行数据分析处理。各组数据经过正态检验和方差齐性分析后，采用单因素方差分析和t检验进行统计学处理。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

造模前各组大鼠皮毛紧密贴身、有光泽，双眼有神，活动较多且敏捷，食欲较好。造模前后各组间体重差异无统计学意义（P＞0.05），造模前各组均无腹泻情况，24h总便粒数差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表1。

表1 各组大鼠造模前体重和粪便情况比较（mean±SD）

2.2 24h总便粒数、稀便粒数、稀便率、稀便级和腹泻指数比较

如表2，造模后，模型组大鼠24h稀便粒数、稀便率、稀便级、腹泻指数均高于空白组（P＜0.05），各组大鼠24h总便粒数差异均无统计学意义（P＞0.05）；治疗后，电针组24h稀便级明显低于模型组（P＜0.05），与空白组差异无统计学意义（P＞0.05），电针组腹泻指数与空白组、模型组相比差异有统计学意义（P＜0.05），电针组24h稀便粒数、稀便率与模型组相比差异无统计学意义（P＞0.05），各组大鼠24h总便粒数差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表2 治疗后各组大鼠排便情况比较（mean±SD）

2.3 肠道MT水平情况

由表3可知，经ELISA检测结果显示，造模后，模型组结、回肠MT、水平明显高于空白组（P＜0.05）。治疗后，电针组结、回肠MT含量均低于模型组（P＜0.05），其中回肠MT水平和空白组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 造模后治疗后结、回肠MT水平（mean±SD）

2.4 肠道5-HT水平情况

如表4所示，经ELISA检测，造模后，模型组结、回肠5-HT水平明显高于空白组（P＜0.05）；治疗后，电针组结、回肠5-HT含量均低于模型组（P＜0.05），且和空白组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

表4 造模后治疗后结、回肠5-HT水平（mean±SD）

2.5 相关性分析

进一步分析2.3和2.4的数据结果，将回肠的MT和5-HT水平，结肠的MT和5-HT水平分别进行相关性分析，发现在治疗结束后回肠5-HT和MT没有相关性（r=0.256，P=0.305），而结肠5-HT和MT存在中等程度的正相关（r=0.537，P=0.022）。

3 讨论

功能性腹泻在临床上是常见的肠道疾病之一，属于中医“泄泻”范畴[13]。祖国传统医学大多认为泄泻病位在肠道，病机涉及肝、脾、肾。饮食不节、情志所伤、感受外邪、脾胃虚弱等多种病因可导致机体肠道失司，脾失健运，水谷精微不布，停聚成湿，湿盛则脾病，而成泄泻。现代医学认为腹泻是肠道动力亢进的表现。MT是由位于第三脑室后壁的松果体分泌的肽类激素，主要分布在神经系统中。在胃肠道中MT亦有分布，其主要是由胃肠道粘膜下分布的EC合成与分泌的[14]。研究发现MT参与了控制胃肠运动，有研究发现小剂量MT结合常规药物治疗消化不良，患者胃肠动力加快，症状明显改善[15]。5-HT是一种联系脑肠轴、参与调节胃肠道运动和分泌功能的重要神经递质，大量的5-HT在肠道内聚集可导致中毒反应及其受体脱敏，从而出现胃肠道动力、分泌功能性及内脏高敏感性异常，与慢性便秘、IBS、腹泻及功能性消化不良等胃肠道功能性疾病的发病密切相关[16]。石卿等在肠易激综合征-腹泻型（Diarrhea Predominated Irritable Bowel Syndrome，IBS-D）模型大鼠中发现，5-HT和MT水平均较空白对照大鼠升高，肠道内大量5-HT可以使肠道收缩力增强，收缩幅度降低，而预先使用大剂量MT处理过的活体标本，5-HT的作用亦减弱[17]。综上，MT可能通过对5-HT信号系统的影响，调控肠道5-HT水平高低，从而控制胃肠运动功能。

针灸对FD的临床疗效确切，可良性调节异常肠道动力。而电针大肠俞募穴是针灸临床治疗功能性便秘和FD最经典、最常用的配穴方法。本研究选取大肠俞募穴，电针治疗FD，观察其对大鼠肠道MT、5-HT水平的影响。从中医角度出发，大肠募穴为天枢，背俞穴为大肠俞，分别为大肠之气输注于胸腹及背腰的腧穴，两穴相配，一前一后、一阴一阳，正如《难经本义》中所述“阴阳经络，气相交贯，脏腑腹背，气相通应”，同时针刺两穴可发挥相辅相成、脏腑同调、平衡阴阳，恢复脏腑正常功能的协同效应。

本研究通过番泻叶水煎剂灌胃建立腹泻模型，效果稳定，灌胃后即出现明显稀便。但可能单纯番泻叶水煎剂灌胃所致的腹泻，其自愈性较好，当停止灌胃后，模型消失[18]。因此本研究不能等造模成功后再进行干预，只能造模与治疗干预同时进行。经ELISA法检测大鼠结、回肠中MT、5-HT水平，结果表明模型组结、回肠MT、5-HT水平明显高于空白组的健康大鼠，说明造模可导致大鼠结、回肠MT、5-HT水平异常升高。干预治疗后，电针组24h稀便级、腹泻指数、结肠和回肠MT、5-HT含量明显下降，其中回肠MT、5-HT和结肠5-HT水平和空白组差不多，说明电针可降低肠道内MT和5-HT因造模升高的异常水平。进一步的数据的相关性分析中发现结肠的MT和5-HT存在中等程度的正相关。由此推测，电针大肠俞和天枢穴可能通过降低MT水平，减少对5-HT信号系统的干扰，促进5-HT的灭活，减少肠道内5-HT的含量，从而缓解肠道紊乱，改善腹泻症状。

通过本研究，我们证实了电针治疗FD疗效确切，其机制与降低肠道内MT、5-HT水平有关。但电针治疗通过调控MT水平如何影响5-HT及其信号系统还有待进一步研究，可考虑进一步检测褪黑素受体（Melatonin receptor，MR）、5-HT转运体（Serotonin transporter，SERT）等相关蛋白的表达情况，以阐释更明确的生物学机制。