沙蚕不同酶解产物抗氧化效果研究

2020-03-15刘天红王颖孙元芹李红艳李晓李阳姜晓东纪蕾

中国农业科技导报 2020年1期

关键词：木瓜清除率蛋白酶

刘天红, 王颖*, 孙元芹, 李红艳, 李晓,李阳, 姜晓东, 纪蕾

(1.山东省海洋生物研究院, 山东省海水养殖病害防治重点实验室, 青岛市浅海底栖渔业增殖重点实验室,山东青岛 266100; 2.中国海洋大学海洋生命学院, 山东青岛 266003)

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用沙蚕为野生非生殖态双齿围沙蚕(非异沙蚕体)，于2017年9月采自山东省东营河口，体质量为300～400尾·kg-1，采集后清洗，吸净表面水分冻存。

碱性蛋白酶(20万U·g-1)、中性蛋白酶(20万U·g-1)、胃蛋白酶(30万U·g-1)、木瓜蛋白酶(80万U·g-1)购自南宁庞博生物工程有限公司；风味蛋白酶(30万U·g-1)购自吉宝中新国际贸易有限公司；胰蛋白酶(28万U·g-1)购自北京索莱宝科技有限公司；杆菌肽(Mw=1 422.69 Da Dr. Ehrenstorfer)，德国LGC GmbH研究所生产；乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(Mw=189.1 Da)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(Mw=451.2 Da)、抑菌肽(Mw=6 511 Da)、细胞色素C(Mw=12 355 Da)，均为德国Biosun公司生产。其他所用试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪(LC-20A，日本岛津公司，带GPC软件)、紫外-可见分光光度计(UV2450，日本岛津公司)、真空冷冻干燥机(北京博医康医学设备有限公司)、高速冷冻离心机(CR21N，日本日立公司)、自动电位滴定仪(ET18，梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司)、水浴恒温振荡器(上海双捷实验设备有限公司)。

1.3 研究方法

1.3.1沙蚕酶解采用沙蚕∶蒸馏水为1∶3(质量比)制备沙蚕浆，6种蛋白酶作为实验组，酶添加量600 U·g-1。以不添加蛋白酶的实验组作为空白对照，其中，原液40 ℃为CKⅠ、原液50 ℃为CKⅡ。按表1中酶解条件，每组设3个平行，分别酶解1、2、3和4 h，沸水浴灭活5 min，8 000 r·min-1离心15 min，上清液过0.45 μm水相滤膜，冻干。

1.3.2水解度测定酶解液氨基态氮的测定参照GB 5009.235-2016食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定[12]，沙蚕匀浆总氮含量参照GB 5009.5-2016食品安全国家标准食品中蛋白质的测定[13]。吸取5.0 mL酶解液置于200 mL烧杯中，加60 mL 水，用氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=0.050 mol·L-1]滴定至pH为8.2，记录消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积数，计算总酸含量。加入10.0 mL甲醛溶液，混匀。再用氢氧化钠标准滴定溶液继续滴定至pH为9.2，记录消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积数。同时取80 mL 水，按上述步骤做试剂空白试验。水解度(degree of hydrolysis，DH)计算公式如下。

表1 不同处理的酶解条件Table 1 Enzymolysis condition in different treatments

1.3.3酶解液中肽分子量分布参照GB/T 22729-2008海洋鱼低聚肽粉[14]中高效凝胶过滤色谱法执行，修正后的色谱条件为色谱柱：东曹(TOSOH) TSKgel G2000SWXL(7.8 mm×300 mm)；流动相：30%乙腈-水+0.1%三氟乙酸(CV)，超声脱气5 min，紫外检测器(220 nm)，流速梯度升至0.5 mL·min-1，进样量10 μL，室温，检测时间35 min。利用GPC软件，以标准品分子-出峰时间作三次方程拟合，计算各酶解液中肽分子量分布。

1.3.4DPPH清除率的测定参照Li等[15]的方法，取0.2 mmol·L-1DPPH甲醇溶液2 mL，甲醇定容至3 mL，测量517 nm处吸光值作为A0；取DPPH甲醇溶液2 mL，加入100 μL不同浓度酶解液(以Vc溶液为阳性对照)，甲醇定量至3 mL，充分混匀，置于暗处反应30 min后，测量517 nm处吸光值作为A，甲醇调仪器零点。反应后体系若有少量沉淀会影响吸光值测定，可以过0.45 μm滤膜去除。DPPH清除率计算公式如下。

△A0=A1-A2

取100 μL不同浓度酶解液(以Vc溶液为阳性对照)，加入2 950 μL Tris-HCl缓冲液，再加50 μL联苯三酚溶液，迅速混合，测量325 nm吸光值。30 s时读数为A样1，每隔30 s测量一次，至读数接近稳定时为A样2，计算公式如下。

△A样=A样1-A样2

1.3.6·OH清除率的测定采用水杨酸法[17]测定·OH清除率，取1 mL 1.8 mmol·L-1FeSO4溶液(取0.05 g FeSO4·7H2O溶于双蒸水，溶解后加入少量H2SO4与还原铁粉，定容至100 mL)、1 mL 9 mmol·L-1乙醇-水杨酸溶液、250 μL双蒸水和1 mL 8.8 mmol·L-1H2O2混合作为A0；取1 mL FeSO4溶液、1 mL乙醇-水杨酸溶液与100 μL不同浓度的样品溶液混合，用双蒸水定量到2 250 μL，最后加入1 mL H2O2混合均匀作为Ax；取1 mL FeSO4溶液、1 mL乙醇-水杨酸溶液与100 μL不同浓度酶解液(以Vc溶液为阳性对照)混合，用双蒸水定量到3 250 μL，混合均匀作为Ax0，均置于37 ℃水浴10 min，于505 nm下测定吸光值。全部溶液现配现用。·OH清除率计算公式如下。

1.4 数据处理

采用Excel 2007整理数据，采用SPSS 18.0进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白酶对水解度的影响

由图1可知，中性蛋白酶组水解度随酶解时间的延长而增长。其他5种蛋白酶酶解2 h时的水解度均比1 h时低，组内差异极显著(P<0.01)，随着酶解时间的延长，水解度又呈明显上升趋势，这可能是酶解过程中氨基态氮不稳定所致。对照组水解度明显低于添加蛋白酶组(P<0.01)，且水解度基本不随时间延长而增长。酶解4 h以后，碱性蛋白酶和风味蛋白酶的水解度最高，达到53.34%；其次是木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，分别达到50.13%和49.69%；CKⅠ水解度最低，仅15.62%。碱性蛋白酶是一种内切酶，主要裂解疏水性氨基酸，增加酶解液中疏水性氨基酸为终端的多肽；风味蛋白酶是一种内切和外切的混合型酶，可在多肽链两端或内部破坏肽键[18]，形成更多的肽段。

注：同一蛋白酶不同酶解时间下不同希腊文字母表示差异在P<0.01水平具有统计学意义，同一酶解时间不同蛋白酶间不同英文字母表示差异在P<0.01水平具有统计学意义。Note: Different Greek letters of the same protease in different enzymolysis time indicate significant difference at P<0.01 level, different English letters of different proteases in the same enzymolysis time indicate significant difference at P<0.01 level.图1 不同蛋白酶对沙蚕蛋白水解度的影响Fig.1 Effect of different proteases on protein DH of clam worm

2.2 沙蚕酶解物分子量的分布

利用GPC软件拟合肽标准品出峰时间-分子量标准曲线，其三次方拟合标准方程为:f(x)=2.656 273 e-3x3-0.147 813 1x2+2.445 461x-8.571 43，R2=0.998 9，相关性良好。由该标准曲线计算各酶解产物分子量分布(表2)。由表2可以看出，未酶解的沙蚕原液分子量在6 511～12 355 Da有明显分布，且与蛋白酶组差异极显著(P<0.01)，经过各蛋白酶酶解后，这一分子段的蛋白含量几乎为零(除风味蛋白酶组外)，说明不同蛋白酶解链降解了这一分子段的蛋白。各酶解产物中含有大量小分子肽(189～6 511 Da，含多肽和寡肽)或氨基酸(<189 Da)，其中胰蛋白酶的酶解产物小分子肽含量最高，达70.47%，比小分子肽含量最低的风味蛋白酶酶解产物(54.77%)高15.7%。这一结果与小麦蛋白酶解情况正好相反[19]，可能是植物蛋白与动物蛋白的结构不同所致。胃蛋白酶酶解产物中小分子肽含量次之，为68.12%。

表2 不同蛋白酶酶解产物分子量分布Table 2 Molecular weight distribution of enzymatic hydrolysis products by different proteases %

2.3 Vc抗氧化效果

表3 不同浓度Vc的抗氧化效果Table 3 Antioxidant activities of Vc with different concentration %

2.4 不同蛋白酶对沙蚕酶解液抗氧化效果的影响

2.4.1不同蛋白酶的DPPH清除效果图2表明，不同酶解条件下，各蛋白酶组和对照组的酶解液浓度与DPPH清除率均呈正相关关系，但同一种蛋白酶在不同酶解时间下对DPPH清除率随酶解液浓度变化又有所不同。胃蛋白酶不同酶解时间下随浓度增加，对DPPH清除率变化趋势基本一致；同一浓度下，不同酶解时间对DPPH清除率相差不大，基本是酶解3 h后DPPH清除率最高。胰蛋白酶酶解1 h时DPPH清除率普遍高于4 h，与胃蛋白酶相反。风味蛋白酶酶解3 h和4 h时的DPPH清除率明显高于酶解1 h，且随浓度的增加而升高，酶解3 h和4 h时DPPH清除率的增长速率明显高于酶解1 h和2 h。木瓜蛋白酶酶解3 h以后，明显比酶解时间短的酶解液对DPPH的清除率高，且当浓度增加到3 mg·mL-1以上时，酶解4 h对DPPH清除率达到60%以上。中性蛋白酶酶解2 h对DPPH清除率反而低于酶解1 h，可能是部分蛋白不稳定造成的，但酶解4 h时DPPH清除率最高。碱性蛋白酶与其他蛋白酶不同，不同酶解时间下随酶解液浓度增加，DPPH清除率的增长斜率不同，酶解4 h对DPPH清除率随着浓度的增加，清除率增加斜率最大。两对照组在不同酶解时间下对DPPH清除率均随浓度的增加而升高，但酶解时间增加到4 h，对DPPH清除能力反而要小，这说明在40 ℃下，部分活性蛋白不稳定。

图2 不同蛋白酶对DPPH清除率的影响Fig.2 Effect of different proteases on DPPH scavenging rate

图3结果表明，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶对DPPH的清除率最高，浓度为2 mg·mL-1时就可清除90%DPPH，与0.3 mg·mL-1Vc的清除效果接近，比对照组清除率高约30%。Rajapakse等[20]研究认为，水解产物清除DPPH自由基活性与疏水性氨基酸或肽呈正相关关系。木瓜蛋白酶是特异性内切酶，作用位点广泛，可从蛋白质内部切开肽链而生成小分子质量的生物活性多肽；胃蛋白酶具有广泛特异性作用位点，主要作用于Phe、Trp、Tyr等疏水性氨基酸，这两种酶均可增加酶解液中疏水性氨基酸含量。胰蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶对DPPH的清除率均比对照组高，但碱性蛋白酶却比对照组低，这说明碱性蛋白酶酶解沙蚕比沙蚕原液本身对DPPH的清除能力要低，可能与其酶解产物中小分子肽被过度水解、丧失了部分功能键有关。

图3 不同蛋白酶在最佳酶解时间下对DPPH的清除率Fig.3 DPPH scavenging rate of different proteases under optimal enzymatic hydrolysis time

图4 不同蛋白酶对清除率的影响Fig.4 Effect of different proteases on scavenging rate

图5 不同蛋白酶在最佳酶解时间下对的清除率 scavenging rate of different proteases under optimal enzymatic hydrolysis time

2.4.3不同蛋白酶的·OH清除率如图6所示，各处理组对·OH清除率与酶解液浓度呈正相关关系。胃蛋白酶在不同酶解时间下的酶解液随浓度增加，对·OH清除率的增加斜率不同，酶解2 h时对·OH清除率最高。胰蛋白酶与胃蛋白酶相似，酶解2 h时对·OH清除率普遍高于酶解4 h。风味蛋白酶与其他蛋白酶组有所不同，酶解1～2 h对·OH清除率比酶解4 h高，可能是由于部分活性蛋白不稳定造成的，酶解3 h对·OH的清除率最高。木瓜蛋白酶1～3 h的酶解产物随浓度增加，对·OH清除率的增长趋势一致，而酶解4 h对·OH清除率增加斜率最大。中性蛋白酶在酶解4 h时对·OH的清除率明显高于3 h。碱性蛋白酶酶解4 h以后，对·OH的清除率明显高于时间短的酶解组，且随酶解液浓度增加到2 mg·mL-1以上，对·OH清除率达到70%以上。对照组对·OH清除率也随着浓度的增加而升高，随着水浴时间增加到3 h，对·OH清除能力最高，但酶解时间再延长，清除能力反而下降，这说明在40 ℃下活性蛋白不稳定。

图6 不同蛋白酶对·OH清除率的影响Fig.6 Effect of different proteases on·OH scavenging rate

图7结果表明，木瓜蛋白酶组在浓度高于2 mg·mL-1时，对·OH清除率最高，与0.5 mg·mL-1Vc的清除效果接近，比空白对照组清除率高约40%。随着酶解液浓度的升高，5 mg·mL-1时胃蛋白酶组的清除效果最优，与木瓜蛋白酶差别不大。胰蛋白酶、风味蛋白酶对·OH的清除率高于对照组，但中性蛋白酶和木瓜蛋白酶清除效果与对照组相近。碱性蛋白酶和胃蛋白酶的酶切位点均为疏水性氨基酸，其酶解产物清除·OH效果较好。