响应面试验优化霍山石斛原球茎增殖培养基

郭慧慧，林丛发，蒋元斌，李志刚

(福建省宁德市农业科学研究所，福建 宁德 355017)

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng)是安徽大别山特有的名贵珍中草药，是兰科多年生附生草本植物，含有活性多糖、生物碱等多种化合物[1]。现代药理研究证明，霍山石斛多糖具有抑制人胃癌细胞生长、延缓糖尿病性白内障发展、保护四氯化碳致小鼠急性肝损伤等作用[2-4]。但由于霍山石斛种子繁殖力极低，生长周期长，生长环境要求极为苛刻，加上人为的过度采挖，自然资源已濒临灭绝[5]。随着植物组织培养技术的发展，许多研究者开始利用这项技术解决石斛苗繁殖率低问题，而试管苗繁殖一般需经过原球茎阶段。原球茎是霍山石斛体细胞胚，具有和植株同样的形态发育和物质代谢的潜能[6]，且其具有生长周期短、繁殖率高等特点，可进一步进行代谢产物调控、生化、分子及蛋白质组学分析[7-9]。因而探索原球茎增殖技术将是可持续开发霍山石斛资源的重要技术环节。

响应面设计是以试验测量、经验公式和数值分析为基础，采用多元二次方程来拟合因素和响应值之间的函数关系以寻求最优工艺的一种统计学方法。相比于正交设计和均匀设计，具有试验次数少、精度高和模型预测性好等优点，现已被广泛运用于提取工艺和方法优化等领域，能够反映各因素与响应值之间的关系[10-12]。

本研究应用响应面分析法从不同浓度萘乙酸(NAA)、6-苄氨基嘌呤(简称6-BA)和马铃薯组合中确定最优的霍山石斛原球茎增殖培养基，旨在为可持续开发霍山石斛资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

萘乙酸与6-苄氨基嘌呤购于北京康倍斯科技有限公司；土豆购于福建宁德福安永辉超市；石斛种苗经浙江大学董海涛教授鉴定为霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC.Z.Tang et S.J Che)，试验所用原球茎由其种子诱导而来。

1.2 仪器与设备

JB-CJ-2FXS超净工作台，苏州佳宝净化工程设备有限公司；YXQ-LS-100G立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；KJ-JD501榨汁机，康佳集团股份有限公司；FA2204电子天平，上海力辰邦西仪器科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1培养方法与条件 在无菌条件下将霍山石斛原球茎分别接种到所配制的增殖培养基中。设NAA浓度、6-BA浓度和马铃薯用量3个变量。每一个处理组均含：1/2MS+蔗糖30.0 g/L+琼脂5.0 g·L-1+变量因子，pH 5.7～5.8,每处理10个平行，每瓶3簇，组培室培养条件为室温(26±1)℃，光照强度2 000 lx左右，光照时间12 h·d-1。

1.3.2单因素试验设计 在预试验的基础上，分别探讨NAA浓度、6-BA浓度和马铃薯用量对霍山石斛原球茎增殖率的影响。控制条件6-BA、马铃薯和NAA的用量分别为1.0 mg·L-1、150 g·L-1和0.1 mg·L-1，变量因子水平设置见表1[13]。

表1 单因素试验设计方案Table 1 Single factor experiment design

1.3.3增殖率 未分化原球茎质量为接种60 d后所得的未分化原球茎质量，未分化的原球茎呈淡绿色，顶端有叶原基，但无真叶分化[14]。

原球茎增殖率=[(未分化原球茎质量-接种质量)/接种质量] ×100%

接种质量=接种后瓶重-接种前瓶重

1.3.4响应面试验设计 在单因素实验分析结果的基础上，确定NAA浓度、6-BA浓度、马铃薯用量3个因素的适宜范围(表2)，以原球茎增殖率为响应值。根据Box-Behnken试验原理进行设计，确定试验所需总试验点[15-18]。

N=2f(f-1)+n

式中，N为所需试验点，f为需要优化的因素数，n为中心点的个数。

本试验中f为3，n为5，共17个随机试验运行优化。随后对响应面法得到的最优方案进行验证。

表2 响应面试验设计因素水平Table 2 Design level table of response surface methodology

1.3.5数据分析 单因素试验数据处理运用的软件为DPS7.05，采用最小显著差数法(P<0.05，LSD)进行不同处理间均值的显著性差异比较。响应面分析采用Design Expert 8.06软件。

2 结果与分析

2.1 不同浓度NAA对霍山石斛原球茎增殖率的影响

植物生长调节剂在培养基中的用量虽然微小，但是其作用很大。生长素在组织培养中的用途主要有诱导愈伤组织形成、诱导根的分化和促进细胞分裂[19]。石斛生长发育过程中主要使用的生长素有IAA、NAA、IBA[20]。如图1所示，NAA的不同添加量对霍山石斛原球茎增殖的影响。当NAA浓度为0.1 mg ·L-1时，原球茎增殖率最大，NAA浓度太高或太低都会降低原球茎增值率。随着NAA浓度的增加可观察到分化的原球茎越来越多。

注：不同字母表示在不同处理下差异在P<0.05水平具有统计学意义。Note: Different letters in the figure mean significant difference among treatments at P<0.05 level.图1 NAA添加量对霍山石斛原球茎增殖率的影响Fig.1 Effect of NAA dose on protocorm proliferation rate of Dendrobium huoshanense

注：不同字母表示在不同处理下差异在P<0.05水平具有统计学意义。Note: Different letters in the figure mean significant difference among treatments at P<0.05 level.图2 6-BA添加量对霍山石斛原球茎增殖率的影响Fig.2 Effect of 6-BA dose on protocorm proliferation rate of Dendrobium huoshanense

2.2 不同浓度6-BA对霍山石斛原球茎增殖率的影响

细胞分裂素是由根尖合成而向上运输，主要作用是促进细胞分裂和器官分化，促进侧芽分化和生长，抑制顶端优势，延缓组织衰老等[21]。石斛生长发育过程中主要使用的细胞分裂素有ZT、KT和BA[20]。如图2可知，6-BA浓度在0.5～1 mg·L-1时，随着6-BA浓度的增加，原球茎增殖率也在增加；6-BA浓度在1～2 mg·L-1时，随着6-BA浓度的增加，原球茎增殖率呈下降趋势。

2.3 马铃薯对霍山石斛原球茎增殖率的影响

天然复合物对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物[21]。石斛生产中常使用的天然复合物有香蕉汁、马铃薯汁及椰子汁等[22]。由图3可知，随着马铃薯浓度的增加，原球茎增殖率呈现先升后降的趋势，浓度为150 g·L-1时原球茎增殖率最高。

注：不同字母表示在不同处理下差异在P<0.05水平具有统计学意义。Note: Different letters in the figure mean significant difference among treatments at P<0.05 level.图3 马铃薯添加量对霍山石斛原球茎增殖率的影响Fig.3 Effect of potato dose on protocorm proliferation rate of Dendrobium huoshanense

2.4 响应面试验结果

三因素三水平的二次响应面结果见表3。可以看出，NAA 0.1 mg·L-1，6-BA 1.5 mg·L-1，马铃薯添加量150 g·L-1时，原球茎增殖率最高，其均值2 820%～3 260%在之间。

表3 Box-Behnken试验设计及结果Table 3 Experimental design and results of Box-Behnken

利用Design Expert 8.06对试验数据进行分析，得到的拟和全变量二次回归方程各变量的方差分析如表4所示。

通过Design Expert 8.06软件对表3试验数据进行多元回归拟和，以原球茎增殖率(Y)为响应值，NAA浓度(X1)、6-BA浓度(X2)和马铃薯用量(X3)为自变量，获得回归方程为：

Y=10 380X1+9 337X2+75.99X3-400X1X2-34.8X1X3-30.68X2X3-38 750X12-2 634X22-0.142 6X32-7 343.5

如表4所示，回归模型的P=0.005 4，表明该模型是极显著的。模型失拟项的P=0.118 4，表明模型失拟不显著，而模型失拟项表示模型预测值与实际值不拟合的概率[23]，即模型失拟项不显著表明模型稳定。模型的R2为0.914 4，说明回归拟和程度较好。变异系数(C.V.)值为13.03%，说明模型方程能够较好地反映真实的实验值。所以，可以使用该模型来预测NAA浓度、6-BA浓度和马铃薯浓度对霍山石斛原球茎增殖的影响。

从表4可见，NAA(X1)和6-BA(X2)浓度的一次项对原球茎增殖率的影响显著(P<0.05)，而马铃薯用量(X3)的一次项对原球茎增殖率的影响不显著(P>0.05)，可能是由于通过单因素试验已将马铃薯的浓度范围缩小在一个较合适的区间，在这区间内马铃薯浓度的变化对原球茎增殖率的影响不显著。NAA浓度(X1)的二次项对原球茎增殖率的影响显著(P<0.05)；6-BA浓度(X2)的二次项对原球茎增殖率的影响极显著(P<0.01)；马铃薯用量(X3)的二次项对原球茎增殖率的影响不显著(P>0.05)。6-BA浓度和马铃薯用量的交互项(X2X3)对原球茎增殖率的影响极显著(P<0.01)，而NAA和6-BA浓度的交互项(X1X2)与NAA浓度和马铃薯用量的交互项(X1X3)对原球茎增殖率的影响不显著(P>0.05)。

表4 响应面模型方差分析Table 4 ANOVA for response surface model

2.5 二次拟合响应面分析

由回归方程得到NAA浓度、6-BA浓度和马铃薯用量这3个因素间交互作用对霍山石斛原球茎增殖培养基影响的响应曲面和等高线图，如图4～6所示。图中等高线最小椭圆中心点即拟合曲面的最高点；而等高线的形状又能反应交互效应的强弱，越接近圆形表示两因素交互作用越不显著，越接近椭圆形表示两因素交互作用越显著[15]。由图4～6可知，三个拟合曲面都具有最高点。从等高线形状来看，6-BA浓度和马铃薯用量两者交互作用变化非常明显(图6)，相比于NAA浓度和6-BA浓度(图4)、NAA浓度和马铃薯用量(图5)，交互作用非常显著(P<0.01)。NAA浓度和6-BA浓度对增殖率的交互影响不显著(图4)，当马铃薯用量位于中心水平(150 g·L-1)时，增殖率随6-BA浓度和NAA浓度的增加均呈现先升后降的趋势。NAA浓度和马铃薯用量对增殖率的交互影响也不显著(图5)，当6-BA浓度为1.0 mg·L-1时，增殖率随NAA浓度和马铃薯浓度的增加均呈现先增加后降低的趋势。

图4 NAA和6-BA添加量对原球茎增殖率影响的响应面曲面和等高线Fig.4 Response surface plot and contour plot showing the effects of NAA and 6-BA dose on protocorm proliferation rate

图5 NAA和马铃薯添加量对原球茎增殖率影响的响应面曲面和等高线Fig.5 Response surface plot and contour plot showing the effects of NAA and potato dose on protocorm proliferation rate

图6 6-BA和马铃薯添加量对原球茎增殖率影响的响应面曲面和等高线Fig.6 Response surface plot and contour plot showing the effects of 6-BA and potato dose on protocorm proliferation rate

应用Design Expert 8.06软件对二次多项式回归方程进行计算，确定最佳三因素组合为NAA浓度0.05 mg·L-1、6-BA浓度0.67 mg·L-1、马铃薯用量188.96 g·L-1，此条件下霍山石斛原球茎增殖率为3 193.79%。考虑实际操作，将NAA浓度、6-BA浓度、马铃薯用量分别修正为：0.05 mg·L-1、0.70 mg·L-1、185 g·L-1。在此条件下进行验证试验，得到霍山石斛平均增殖率为2 989.82%±205.55%，与模型预测值3 193.79%非常接近。

3 讨论

随着野生资源的过度开采及市场需求的增加，利用离体快繁技术进行原球茎增殖被认为是解决霍山石斛药源的有效途径。而原球茎的生长受到植物生长调节剂、添加物、培养方式、培养基渗透压等诸多因素的影响。戴传云等[24]研究表明，高浓度的6-BA与低浓度的NAA组合，原球茎增殖系数大，增殖效果较好，NAA对原球茎增殖的影响大于6-BA。谢纯[25]研究表明，当NAA浓度固定时，随6-BA浓度不断升高，原球茎增殖速度加快，但当浓度高于1.5 mg·L-1时，原球茎生长速度反而减慢；当6-BA浓度固定时，NAA对原球茎增殖速度的影响表现为先增后减，浓度为0.5 mg·L-1时原球茎长势最好，这与本研究的结果相似。肖小君等[26]研究表明，马铃薯汁可促进铁皮石斛原球茎增殖，且原球茎饱满，颜色浓绿，长势旺盛。苏江[27]研究表明，甘露醇可用来调节石斛培养基渗透压，添加低浓度的甘露醇可促进石斛原球茎的生长。侯丕勇等[28]研究表明，减低固体基本培养基元素的含量有利于原球茎的生长，但不利于原球茎的分化。万珠珠等[29]研究表明，相比塑料杯，玻璃瓶中的原球茎增殖系数大，萌发度高，生长健壮。

目前，石斛原球茎增殖因素优化使用的方法多为单因素试验和正交试验设计法，利用响应面法优化原球茎增殖培养基的方法尚未见报道。单因素试验实验设计简单，但忽略了因素之间的交互作用。正交试验可同时考虑几种因素，寻求最佳组合，但无法找到整个区域的最优值。本研究使用的响应面法即可考察因素之间的交互作用，又可寻找到整个区域内的最优解，进一步降低了培养基用量，从而降低成本。试验通过单因素试验确定了主要因素及因素最佳浓度存在的范围后，再通过响应面分析充分考虑NAA、6-BA和马铃薯之间的交互作用，并通过相应曲面寻找最优解。臧琛等[30]研究表明响应面法可用于石斛真空冷冻干燥工艺条件的优化，其建立的模型预测性较好。彭文书等[12]研究表明响应面法建立的模型预测性良好，可用于石斛生根培养基的优化。荆晶等[31]研究表明响应面法可对微波辅助法提取石斛多糖工艺条件进行优化，所得工艺稳定可靠，方便可行。本研究应用响应面法优化霍山石斛原球茎增殖培养基，以期为霍山石斛药源工厂化生产提供理论和实践依据。