血清mRNA-122对药物性肝损伤患者早期药物肝毒性评价的价值

寇曦曦

临床上肝毒性评价方面主要依赖超微病理学、临床生化指标(如总胆汁酸、血清转氨酶等)、活性代谢产物、组织病理学、免疫相关指标，但这类指标稳定性、灵敏性、特异性较差，无法为其提供早期确切信息[1]。近几年，有报道显示肝特异性mRNA-122(microRNA-122，miR-122)调控肝细胞生长、发育、分化、代谢、应激等过程，相较于传统肝毒性评价指标，其能准确区分肝外损伤与肝损伤；与组织病理学结果具有明显相关性，有望成为早期药物肝毒性评价的生物标志物[2]。但目前鲜有关于miR-122评价药物性肝损伤(drug-induced liver injury，DILI)患者早期药物肝毒性的报道，故本文开展相关研究，旨在为DILI防治提供参考依据，报道如下。

资料与方法

一、一般资料

纳入2016年4月至2019年4月于我院收治的84例DILI患者为对象，获我院医学伦理委员会批准。诊断标准：参考《药物性肝损伤诊治指南》[3]，均经肝穿病理确诊为急性药物性肝损伤，排除其他病因所致肝损伤；存在与药物性肝损伤发病规律一致的潜伏期；停药后异常肝脏指标迅速恢复；再次用药反应呈阳性。纳入标准：(1)年龄>18岁，首次发病；(2)均于用药1个月内出现肝功能损害，白细胞增加，伴发热、皮疹、黄疸、瘙痒等初发症状；(3)药物淋巴细胞刺激试验呈阳性；(4)偶然用药后再次出现；(5)抗丙型肝炎病毒抗体、乙肝表面抗原、抗人类免疫缺陷病毒抗体检测结果均呈阴性；(6)知情同意。排除标准：(1)既往有过量饮酒史；(2)伴自身免疫性肝炎、脂肪性肝炎、脑出血、病毒性肝炎、酒精性肝炎及其他严重肝脏疾病；(3)伴心、脑、肾、肺等严重脏器功能障碍及精神疾患者；(4)肝癌及其他恶性肿瘤。将纳入的84例DILI患者设为观察组，另选取同期入选的90例健康体检者为正常对照组，两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组一般资料比较[(±s)，n(%)]

二、 方法

(一)miR-122检测 采用Trizol试剂盒 (日本Takara公司)提取血清中总RNA，应用Nanodrop ND-1 000分光光度计(美国Thermo Fisher公司)，以分光光度法行总RNA浓度和纯度检测。采用Prime-Script®RT reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)逆转miR-122，逆转录试剂包括样本RNA 1μg、DEPC水13 μL、Bulge-loop RT Primer 2 μL、反转录酶5×Prime-script RT Enzyme Mix 2 μL、反应缓冲液5×Primescript Buffer 4 μL。逆转录条件：42℃60min，70℃10min。将miR-122逆转录为cDNA后置于-20℃保存。内参基因取U6，采用逆转录实时荧光定量PCR方法(荧光定量PCR仪Step one plus，美国Applied Biosystems公司生产)测定U6、血清miR-122。反应体系：cDNA 2 μL，SYBR Green solution 10 μL，上下游引物均为0.4 μL，去离子H2O 7.2 μL。反应条件：95℃预变性10min，95℃变性2 s，60℃退火20 s，70℃延伸10 s，循环40次，软件分析Ct值。引物由美国SBI公司合成。采用公式2-△△Ct，对miR-122在DILI中的相对表达量进行计算，ΔCt=miR-122Ct-U6Ct。

(二)肝功能指标检测 采用HITA-CHI-7080型全自动生化分析仪(日本日立产业株式会社生产)及相配套试剂，检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine transaminase，ALT)、总胆红素(total bilirubin，TBil)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、门冬氨酸氨基转移酸(aspartate transaminase，AST)。

三、 观察指标

观察两组miR-122表达及肝功能指标TBil、AST、ALT、ALP水平，分析miR-122表达与上述肝功能指标的相关性。

四、 统计学方法

结 果

一、 两组miR-122表达及ALT、TBil、ALP、AST水平比较

观察组miR-122表达及ALT、TBil、ALP、AST水平均显著高于对照组(P<0.05)，见表2。

二、 DILI患者血清miR-122表达与ALT、TBil、ALP、AST的相关性分

经直线相关分析显示，DILI患者血清miR-122表达与ALT、AST水平呈线性正相关(r=0.662、0.698，P=0.000、0.000)，与TBil、ALP水平呈线性正相关(r=0.732、0.624，P=0.000、0.000)，见图1～4。

表2 两组miR-122表达及ALT、TBil、ALP、AST水平比较(±s)

图1 miR-122与ALT的线性相关图

图2 miR-122与TBil的线性相关图

图3 miR-122与ALP的线性相关图

图4 miR-122与AST的线性相关图

讨 论

miR-122处于人类基因组第18号染色体，属内源性小分子单链RNA，可经调节其作用靶基因调控基因转录后表达。目前临床证实肝特异性表达的miR-122在肝组织中呈高度表达，表达量为肝中miRNAs的70%以上，在其他组织中呈低表达或不表达[4-5]。古巧燕等[6]采用乙酰氨基苯酚灌胃法建立急性药物性肝损伤动物模型，发现模型组灌胃8、16、24 h时血清miR-122水平较对照组有显著差异，且与ALT、AST水平呈正相关，与ALP、TBil水平无明显相关性(可能与动物模型病理损伤部位有关)，推测急性药物性肝损伤血清miR-122水平升高预示肝细胞损伤加重。

本研究结果显示，观察组miR-122表达及ALT、TBil、ALP、AST水平均明显高于对照组，而直线相关分析显示DILI患者血清miR-122表达与上述肝功能指标均呈线性正相关，推测miR-122可能参与DILI发病过程，笔者推测，可能与miR-122特性有关，miR-122主要经与编码区碱基和靶mRNA 3’-或 5’-非翻译区互补配对，对靶mRNA稳定性进行调整，转录后水平对靶基因表达起着调控作用。而miR-122水平改变往往早于蛋白水平，可经组织细胞损伤致其被动漏出方式，或经微泡分泌后以RNA结合蛋白形式进入血液循环。发生药物性肝损伤时，血清miR-122表达显著升高，与肝组织病理学变化程度和血清ALT、TBil、ALP、AST存在明显相关性，与其检测方法(实时定量PCR)的高特异性、高敏感性也有关。也有报道认为循环中miR-122表达水平明显上调，推测组织损伤时其与循环中AST、ALT类似，由受损组织细胞分泌而来，能更好反映肝细胞损伤程度[7]。

综上，血清miR-122在DILI患者早期药物肝毒性评价中具有重要价值，临床应引起足够重视。但因样本量偏小，未涉及其他种类的miRNAs，并未探讨不同DILI病理类型、严重程度与血清miR-122的关系，故今后有待进一步深入调查研究。