UPLC-MS/MS法测定犬血浆中的雷公藤次碱及体内药动学研究＊

杨 炀，宋小仙，涂如霞，兰 波，吴思澜，

莫宗成，罗金萍，张 莉，刘剑毅＊＊

（重庆市中药研究院 重庆 400065）

雷公藤次碱为雷公藤中常见生物碱，从雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook）.F.（TWHF）根和皮中提取出，是雷公藤根皮中主要生物活性物质，含量较高，具有明显的体液免疫和细胞免疫抑制作用，被广泛用作治疗广谱自身免疫性和炎性疾病的中药，包括类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，强直性脊柱炎，牛皮癣和特发性IgA 肾病[1-2]，活性较强且毒性小于雷公藤甲素，越来越受关注[3]。经雷公藤提取上市的雷公藤多苷片成功的应用于临床多年[4-5]，其治疗特征可归因于两大类成分：萜类化合物和吡啶生物碱类化合物，萜类包括雷公藤内酯，三萜化物和三萜内酯，吡啶生物碱类包括雷公藤碱、雷公藤次碱、雷公藤春碱等。研究表明雷公藤次碱是雷公藤多苷片的代表性化合物之一[6]。迄今为止，报道了雷公藤甲素、红素等药代动力学[7-9]，但吡啶生物碱的药代动力学信息仍然非常有限，因此有必要对雷公藤次碱进行体内药代动力学研究。

目前，超高效液相-串联质谱法（UPLC-MS/MS）是天然产物分析中最有效的分析技术之一[10]。UPLC 的分离度明显优于HPLC，其色谱峰扩展很小，峰浓度很高，有利于化合物的离子化，同时有利于与基质杂质的分离，降低基质效应，使灵敏度和重现性大大提高[11]。质谱及质谱联用对目标化合物进行不同的碎片扫描，可有效识别混合物中的目标化合物，显著提高信噪比[12]。UPLC-MS/MS 将色谱的高鉴别性能和质谱的高分离特点完美结合，具有高分离能力，高灵敏度，应用范围广和专属性强等特点，符合现代药物分析研究对高精密度和准确度分析方法的需求[13]，广泛运用于中药复杂成分研究及环境分析、药物分析等领域。本实验以雷公藤中雷公藤次碱为研究对象，建立了UPLC-MS/MS 法检测雷公藤次碱的犬血浆浓度，表征了雷公藤次碱的药代动力学，明确了雷公藤次碱在犬体内作用规律，对雷公藤次碱的临床使用提供重要参考。

1 实验材料

1.1 试药与仪器

雷公藤次碱（北京融诚鑫德科技发展有限公司，纯度≥98%；批号：L-053180122），雷公藤春碱（北京融诚鑫德科技发展有限公司，纯度≥98%；批号：L-103-171216）；醋酸铵（ACS公司，批号：35Y1402KS）。

高分辨质谱系统（美国AB SCIEX 公司，型号：API 4000）；超高效液相系统（日本岛津公司，型号：LC-30AD）；十万分之一精密电子天平（瑞士Mettler Toledo公司，型号：XS105DU）；涡旋仪（英国Stuart 公司，型号：SA8）；离心机（美国Beckman Coulter 公司，型号：Microfuge 22R）；超纯水净化系统（美国密理博公司，型号：Elix10）。

1.2 实验动物

Beagle 犬，普通级，雌性各半，体重7.0-9.0 kg，购自重庆市中药研究院实验动物研究所，生产许可证号：SCXK（渝）2017-0003，动物检疫及适应性饲养2周。

2 实验方法

2.1 对照品与供试品溶液的制备

分别精密称量对照品雷公藤次碱和内标（雷公藤春碱）各10.25 mg、10.17 mg 于100 mL，加乙腈制成102.50 µg·mL-1雷公藤次碱与101.70 µg·mL-1内标储备液溶液。雷公藤次碱用乙腈系列稀释为5.13、10.25、25.63、51.25、76.88、102.50、128.13、256.25 ng·mL-1，内标用乙腈稀释为101.70 ng·mL-1。

含药血浆对照品的制备：精密吸取50 µL 混合空白血浆于1.5 mL EP 管中，分别精密加入系列浓度雷公藤次碱及100 ng·mL-1内标对照品溶液各10 µL，涡旋 混 匀30 s 后 加 入400 µL 甲 醇，涡 旋 混 匀2 min，12000 rpm 离心15 min，取上清150 µL 于进样瓶中，2 µL 进样分析。同法制备低、中、高浓度（10.25、51.25、205.00 ng·mL-1）的质控溶液。

表1 MRM离子对条件

供试品溶液的制备：称取70 mg HTⅡ于烧杯中，加入适量0.5% CMC-Na 溶液搅拌均匀，定容至175 mL，即得400 µg·mL-1（高剂量）的HTⅡ混悬液；取高剂量混悬液70 mL，加入70 mL 0.5%CMC-Na 溶液，混匀，即得200µg·mL-1（中剂量）的HTⅡ混悬液；取中剂量混悬液50 mL，加入50 mL 0.5% CMC-Na 溶液，混匀，即得100µg·mL-1（低剂量）的HTⅡ混悬液。

2.2 给药和样品采集

取Beagle 犬30 只，雌雄各半，分为3 组，每组10只，即高剂量组（400 µg·kg-1）、中剂量组（200 µg·kg-1）、低剂量组（100 µg·kg-1）。将配制好的供试品溶液按1 mL·Kg-1单次灌胃给予，给药前采集空白血样，灌胃后于0.5、1、1.5、2、4、6、8、24 h 前臂头静脉采血，约取1.5 ml 全血置于入肝素钠抗凝管中，3000 r·min-1离心10 min，分离血浆，再分为两管（一管取50µL，剩余血浆放置于另一管，备用），-80℃冷冻保存备用。

2.3 色谱与质谱分析条件[14-15]

液相条件：ACE Super C18柱（2.1×100 mm id，5µm，菲罗门），流动相为2 mM 醋酸铵（0.2 %甲酸）（A）：乙腈（B），梯度洗脱（0-0.5 min，15% B；0.5-1.5 min，15%-90% B；1.5-3.6 min，90% B；3.6-3.7 min，90%-15% B；3.7-5.5 min，15% B），体积流量350 µL·min-1，柱温30 ℃，进样量2µL。

质谱条件：采用ESI-Positive-MRM 模式，雾化气（Gas1）：55Psi，辅助气（Gas2）：55 Psi，源喷射电压（IS）：5500 V，雾化温度（TEM）：600°C，CAD：4 Psi，气帘气（CUR）：15 Psi，质谱条件优化如表1。

2.4 血浆样品的处理与测定

图1 雷公藤次碱和雷公藤春碱犬血浆样品的专属性色谱图

采用甲醇除蛋白进行前处理：精密移取50 µL 血浆样品，精密加入水与100 ng·mL-1内标对照品溶液各10 µL，涡旋混匀30 s 后加入400 µL 甲醇，涡旋混匀2 min，12000 rpm 离心15 min，取上清150 µL 于进样瓶中，2µL 进样分析。采用本文中建立的UPLC-MS/MS法测定血浆中雷公藤次碱浓度，DAS3.0分析其主要药动学参数。

3 实验结果

3.1 方法专属性

取对照品储备液，采用乙腈稀释，得到102.50 ng·mL-1雷公藤次碱对照品溶液（图C）与101.70 ng·mL-1内标对照品溶液（图D）。精密移取50 µL 血浆样品，分别精密量取乙腈（图A）、水（图B）、102.50 ng·mL-1雷公藤次碱（图E）与101.7 ng·mL-1内标（图F）对照品溶液各10µL，按“2.4”项下方法进行除蛋白处理后进样，离子流图如图1，结果显示雷公藤次碱和内标的出峰时间分别为2.99、2.73 min，峰型良好，两者的分离度好，空白血浆在样品峰及内标峰处的干扰小，专属性强，适用于犬体内血浆样品的测定。

3.2 线性范围和定量限、检测限

取对照品储备液，按“2.1”项下含药血浆对照品的制备方法，分别制备5.13-256.25 ng·mL-1血浆对照品，取储备液重复配制3 组。以3 组对照品峰面积与内标峰面积比值的平均值为纵坐标、对照品的浓度为横坐标，进行线性回归，计算回归方程及相关系数，结果见表2，表明雷公藤次碱与内标峰面积比值在5.13-256.25 ng·mL 范围内标准曲线线性关系良好（r >0.99）。将对照品溶液分别逐步稀释并进行测定，并以信噪比S/N = 3 和S/N = 10 时各对照品的量作为检测限（LOD）和定量限（LOQ），结果测得，定量限为4.94 ng·mL-1，检测限为0.49 ng·mL-1。

表2 线性关系

3.3 基质效应

分别精密吸取5 只Beagle 犬空白血浆各50µL 于EP管中，精密加入纯水20µL，涡旋混匀30 s后加入甲醇400 µL，涡旋混匀，12000 rpm 离心15 min，各取上清160 µL 于新的EP 管中，分别精密加入102.50 ng·mL-1的雷公藤次碱及101.70 ng·mL-1内标对照品溶液各20µL，涡旋混匀30 s，进样分析，得峰面积A。分别精密吸取上述相同浓度的雷公藤次碱及内标对照品溶液各20 µL，加甲醇溶液160 µL，涡旋混匀30 s 后，进样分析，得峰面积B。以公式B/A×100%计算基质效应，计算血浆样品的基质效应。雷公藤次碱基质效应分别为80.82%、98.53%、104.46%、115.03%、110.77%，内标基质效应分别为88.64%，100.02%，102.11%，97.10%，91.99%，平均值分别为101.92%、95.97%。表明该检测方法无明显离子增强或抑制效应。

3.4 精密度及准确度

取低、中、高浓度（10.25、51.25、205.00 ng·mL-1）的质控溶液，每个浓度重复制备5份，分一天和三天重复测定一批和三批，以当日随行标曲计算样品浓度，计算低、中、高浓度质控溶液的一天和三天的批内及批间精密度，结果显示低中高浓度批内精密度的RSD 分别为6.95%，10.73%，9.66%，批间精密度分别为7.83%，5.40%，3.77%，批内批间精密度均小于15%；低中高浓度平均回收率分别为113.55%、109.43%、91.10%，RSD 分别为12.14%，9.00%，10.83%，平均回收率均在91.10%-113.55%之间，且RSD 均小于15%。表明该方法精密度及准确度良好。

3.5 提取回收率

取低、中、高浓度（10.25、51.25、205.00 ng·mL-1）的质控溶液，另取对应浓度相同的低、中、高3 个浓度的对照品溶液，每个浓度制备5份样品，每个样品分析一次，将样品的检测信号与未经提取处理的相应浓度的标准溶液的检测信号比较，得到低中高浓度平均提取回收率分别为：112.76%、82.86%、95.72%，提取回收率在82.86%-112.76%之间。

3.6 稳定性

制备低、中、高浓度雷公藤次碱对照品，每个浓度平行5份，考察处理过程中的室温放置12 h的稳定性；制备低、中、高浓度雷公藤次碱血浆样品，每个浓度平行5 份，考察低、中、高浓度含药血浆样品除蛋白处理前室温放置12 h 过程的稳定性，考察低、中、高浓度血浆样品除蛋白处理后样品盘（4℃）中放置12 h 的稳定性，考察低、中、高浓度样品反复冻融三次的稳定性，考察低、中、高浓度血浆样品低温（-80℃）长期放置（10 天）的稳定性，结果见表3，显示中、高浓度RSD 均小于15%，低浓度RSD 均小于20%，表明雷公藤次碱各稳定性均符合要求。

3.7 雷公藤次碱在Beagle犬体内的药动学研究

雷公藤次碱高、中、低剂量组给药后，采集各时间点血浆，按“2.4”与“2.3”项下方法处理与测定后，得到犬血浆药时曲线见图2；将测得的血药浓度-时间数据采用DAS 3.0 软件处理，雷公藤次碱的药动学参数见表4；药动学参数与剂量和性别比较后结果见表5。由表可知：Tmax 均在1.1h 左右；高剂量组雄犬、雌犬的AUC（0-24h）为低剂量组的1.84、4.85 倍；中剂量组雄犬、雌犬的AUC（0-24h）为低剂量组的1.40、1.37倍；高剂量组雄犬、雌犬的Cmax为低剂量组的1.99、6.67倍；中剂量组雄犬、雌犬Cmax 为低剂量组的1.17、1.73 倍；而高、中、低剂量组的剂量比为4∶2∶1，表明雷公藤次碱吸收较快，在Beagle 犬体内的系统暴露随剂量的增大而增加，有呈比例增加的趋势。中低剂量组的AUC（0-24h）与Cmax 的雄雌比分别为1.06、1.03、0.98、1.44倍，而高剂量组的AUC（0-24h）与Cmax 的雄犬/雌犬分别为0.39、0.43，表明除高剂量组给药后雷公藤次碱在雄性Beagle 犬体内的暴露明显小于雌性外，其余剂量组给药后雷公藤次碱在雄性Beagle犬和雌性Beagle犬体内的系统暴露未见明显差异。

表3 雷公藤次碱稳定性试验结果（ng·mL-1，±SD，n = 5）

表3 雷公藤次碱稳定性试验结果（ng·mL-1，±SD，n = 5）

考察状态0 h对照品室温放置12 h样品处理前室温放置12 h样品处理后样品盘放置12 h样品低温放置10天反复冻融稳定性3次理论浓度10 50 200 10 50 200 10 50 200 10 50 200 10 50 200 10 50 200检测浓度9.07±1.05 50.27±5.47 188.06±16.08 9.22±0.95 47.05±3.21 188.44±10.24 9.93±1.28 46.96±2.64 189.12±15.32 8.76±1.40 50.21±0.67 191.41±16.24 8.99±1.01 47.29±6.15 199.76±10.54 10.46±1.14 47.46±3.24 195.21±14.34 RSD%11.56 10.87 8.55 14.71 7.23 8.40 18.84 10.48 10.81 16.76 5.09 3.54 15.83 9.11 7.84 18.34 10.15 10.18

雄性t1/2z的高中低剂量组均保持在8.5 h 左右，雌性t1/2z的高中低剂量组均保持在5.1 h 左右；雌犬高中低剂量的CLz/F基本无差异，而雄犬的CLz/F随剂量增大有所增加；表明雷公藤次碱的消除与剂量无关，与性别有关。

4 讨论

4.1 血浆样品前处理及色谱条件优化

本研究比较了比较了甲醇、乙腈除蛋白效果，发现甲醇除蛋白后回收率高，且基本无基质效应，故选择甲醇作为蛋白沉淀试剂；甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸水、乙腈-甲酸铵甲酸水以及乙腈-乙酸铵甲酸水等流动相，发现雷公藤次碱在乙腈-甲酸铵甲酸水条件下响应最高，且拖尾影响最小，因此选择乙腈-2 mM醋酸铵含0.2%甲酸水作为流动相。

4.2 剂量设定

图2 雷公藤次碱血药浓度-时间曲线（±SD，n = 5）

表4 雷公藤次碱在犬血浆中的主要药动学参数（±SD，n = 5）

表4 雷公藤次碱在犬血浆中的主要药动学参数（±SD，n = 5）

注：*为与雄性比较，P<0.05

CLz/F/(L kg-1 h-1)1.78±0.57 0.59±0.43*0.96±0.46 0.63±0.58 0.71±0.35 0.64±0.17组别高剂量组性别中剂量组低剂量组雄雌雄雌雄雌Tmax/h 1.00±0.35 1.30±0.27 1.00±0.41 1.10±0.42 1.10±0.42 1.30±0.45 AUC(0-24 h)/(µg L-1*h)302.5±87.6 772.6±156.6*230.6±104.8 217.9±70.5 164.4±42.6 159.2±48.2 Cmax/(µg L-1)69.3±14.3 161.8±39.8 41.0±15.1 42.0±17.8 34.9±12.7 24.3±8.7 t1/2z/h 8.84±1.41 4.92±1.62 8.69±2.23 4.70±1.42 8.01±1.19 5.88±0.93

表5 雷公藤次碱在犬血浆中药动学参数组别与性别比值分析

雷公藤次碱为雷公藤多苷片的主要成分之一，在雷公藤多苷片中含量约为20 µg·mg-1, 雷公藤多苷片临床人用剂量最大为1.5 mg·kg-1，折算成犬的等效剂量约为3 mg/Kg，其中雷公藤次碱剂量约为60µg·kg-1。现报道雷公藤多苷大鼠的生殖毒性[16]、血液系统毒性[17]及肝毒性剂量[18-19]，在94.5-150 mg·kg-1剂量范围内，折算成雷公藤次碱犬的剂量为529-840 µg·kg-1。综合文献雷公藤多苷片在犬血浆中药代动力学研究[20]、雷公藤免疫抑制药效[21]、毒性剂量及根据新药非临床药代动力学研究试验设计原则，设计了本文Beagle犬给药剂量。

4.3 药动学

药动学结果显示高剂量组不同性别的Cmax、AUC(0-24h)差异较大，因此我们选择将雌雄分开统计。其AUC、Cmax 等随给药剂量的增加而增大，有呈比例增长的趋势，且其t1/2、CLz/F 与剂量无关，雷公藤次碱在Beagle 犬体内的药动学过程应属于线性动力学过程，但高剂量组雄性产生明显差异，可能由以下几个方面导致：1.雌雄对雷公藤次碱的消除有差异；2.随着给药剂量的增大，雷公藤次碱对犬产生了毒性反应；3.在给药过程中，或样品前处理过程中带来了误差，导致样品测定结果产生误差，导致血药浓度和用药剂量不成比例关系。清除率（CLz/F）变大会导致血药浓度以及Cmax降低[22]，与雌性比较，高剂量组雄性的CLz/F变大后，AUC 和Cmax 确有不同程度的降低，说明高剂量不仅影响了代谢及排泄，且对吸收也产生了影响。根据文献报道雷公藤生物碱类物质可损伤肝细胞、破坏红细胞、引起进行性贫血[23]，雷公藤具有胃肠毒性及肾毒性，而雷公藤次碱的胃肠毒性及肾毒性未见报道。后期可采用长期给药毒代动力学试验进行验证。本研究雷公藤次碱在犬体内药动学特征与文献中报道[20]的基本一致。

本研究建立了一种准确，灵敏，快速的LC-MS/MS方法，该方法的开发和验证成功应用于测定Beagle 犬血浆中的雷公藤次碱灵敏度高，响应线性好，精密度和准确度高。在Beagle 犬中首次单独给予雷公藤次碱并对其药动学特征进行了评价，为雷公藤次碱的药代动学及毒代动力学研究提供设计依据。