灵芝酸对小鼠点阵激光术后皮肤损伤的防护作用＊

李仲娟，杨细风，谌章舟，陈用军

（1. 湖北理工学院医学院 黄石 435003；2. 湖北省肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室 黄石 435003；3. 鄂东医疗集团黄石市中心医院 湖北理工学院附属医院 皮肤科 黄石 435000）

目前，点阵激光术被广泛应用于临床皮肤疾病治疗及皮肤美容[1]。激光术后的机体的状态直接关系皮肤感染、皮肤修复过度等不良反应。也有学者指出，临床上长期过度使用激光治疗还会带来一定的皮肤癌变风险[2]。这也是当代皮肤疾病治疗及皮肤美容技术的欠缺。作为临床的一种治疗手段，调节机体的状态来弥补这些缺陷是非常必要。传统中药灵芝在《本草纲目》中记载灵芝具有益气血、安心神、健脾胃的功效[3]。现代医药技术纯化的灵芝酸是灵芝中特有三萜类成分，也是机体免疫机能调节的主要活性成分[4]。在局部的皮肤修复及全身的抗癌免疫活动中有重要作用[5]。本研究通过研究灵芝酸对点阵激光治疗术后小鼠皮肤损伤，体内的炎性反应及与皮肤癌变风险相关的Bcl-2蛋白和p53蛋白的表达，来探讨灵芝酸对点阵激光治疗术后黏膜免疫中的防御机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF 级2 月龄KM 小鼠，体质重25-35 g，雌性，共24 只，由湖北省实验动物研究中心提供，动物编号：SCXK（鄂）2015-0018。

1.1.2 主要仪器与试剂

吉林科英激光技术有限责任公司的二氧化碳点阵激光治疗机，长沙湘智速离心机，日本Olympus 的Bx53 显微镜，飞科fs360 电动剃须刀。浓度为20 mg/mL 灵芝酸化合物由日本灵芝研究所友情提供，以熊果酸和齐墩果酸作为标准品，灵芝酸的纯度大于98%。IL-6，TNF-α 和IFN-γ 酶联免疫检测试剂盒购自北京达科为生物技术有限公司。Bcl-2，p53 和Bax蛋白的免疫组化试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司。。

1.2 方法

1.2.1 CO2点阵激光照射小鼠皮肤

将小鼠随机分成照射对照组和给药组，每组12只在相同的环境下饲养一周，将小鼠背部两侧毛发用剃刀剔除干净，使其皮肤裸露，将两组小鼠送往黄石市中心医院用欧洲之星2940 饵激光照射小鼠左侧背部裸露皮肤，照射完成后给药组立刻2 mg/kg的灵芝酸溶液灌胃，然后将小鼠置于适宜条件下饲养，第二天观察小鼠点阵激光照射部位皮肤变化并记录。两组小鼠均为每周照射一次，并持续照射四周。

1.2.2 提取小鼠取血样

点阵激光照射小鼠皮肤四周后，停止照射，将小鼠固定倒立，用剪刀剪开颈部皮肤和动脉，用10 mL EP 管装取颈部动脉血，放置2 小时，转速3000 r/min，离心10 min。取上层血清置于2 mL EP 管中，编号标记放入冰箱中冷冻保存备用。

1.2.3 小鼠皮肤切片制作与HE染色

用剪刀和镊子将取血后的小鼠背部点阵激光照射部位的皮肤剪下，将取下的样本皮肤放入4%甲醛溶液中固定24 h。乙醇梯次脱水硬化后进行包埋切片。切片样本二甲苯脱蜡洗涤多次后，经无水乙醇和纯净水的多次洗涤完成脱蜡。形成小鼠皮肤切片的样片。

取样片用苏木精染液浸染5 min，纯净水洗去染液，用1%的盐酸乙醇分化液洗涤10 s，0.5%伊红液浸染3 min；85%乙醇洗涤脱水15 s，95%乙醇重复洗涤脱水后中性树胶封固备用。

1.2.4 血液细胞因子的测定

IL-6、INF-γ或TNF-α按试剂盒检测说明书进行。取包被抗单克隆抗体96孔酶标板，分别加入100 uL已知浓度的标准抗体或各组小鼠的血清，37℃孵育1 h，洗3 次。再加入100 uL 酶标抗抗体,继续孵育1 h，洗3次后加入等量底物液，室温孵育15 min，加入终止液后，酶标板比色。已知浓度的标准抗体绘制标准曲线,并根据标准曲线计算样本细胞因子水平。常温下15 min 内用450 nm 波长的酶标仪检测OD 值。IL-6、TNF-α、IFN-γ均以上述操作完成。

1.2.5 免疫组化法检测p53 蛋白和Bcl-2 蛋白的表达分析

取小鼠皮肤切片的样片，每张片子滴加一滴3%的过氧化氢，室温下孵育5 min，消除内源性过氧化物酶的活性；滴加一滴稀释倍数为1∶200 的p53 蛋白或Bcl-2 蛋白一抗工作液，37℃孵育2 h；用PBS 缓冲液冲洗5 min，重复洗涤3次；滴加辣根酶标记的p53蛋白或Bcl-2 蛋白第二抗体工作液，37℃孵育30 min；再用PBS 缓冲液冲洗5 min，重复洗涤3 次；每张切片滴加1滴新鲜配制的DAB 液显色20 min，最后用淡苏木素复染细胞核30 s；不同浓度乙醇完成脱水；二甲苯洗涤后中性树胶封固备检。Bcl-2 和p53 阳性细胞胞浆着色呈棕黄色，不显棕黄色者为阴性细胞；采用数码显微镜观察并在高倍镜下采集图像，每张组织切片不少于3 个视野。图像输入免疫组化图像分析系统，分析测定卵巢组织不同视野的平均光密度值。

1.2.6 统计学处理

3 实验结果

3.1 点阵激光术前后小鼠皮肤观察

如图1 所示，图1A 为没有进行激光术的正常小鼠，其毛色光洁柔顺；图1B为照光后小鼠反则皮肤，剃毛后可见其皮肤光滑无损伤及瘢痕；图1C为激光术后给药组小鼠的皮肤，可见皮肤表面粗糙，有部分红斑；与图1D 相比的皮肤粗糙有结痂并伴有脱屑等临床反应要轻。图2A 和图2C 为未照光小鼠皮肤HE 染色图片，图2B 和图2D 为照光小鼠皮肤HE 染色图片，其中图2C 和图2D 为照射激光完成后给药组立刻灌胃2 mL 0.2%的灵芝酸溶液小鼠。图2A 和图2C 表现正常皮肤特征，表皮细胞多层，纤维及胶原组织丰富，表皮和基底层分明。图B中可见皮肤角质层增厚伴随大量炎性细胞浸润。图2D 中小鼠的表皮细胞层次较少，炎性反应比图2B 较轻。图2 为多次试验中的代表。

图1 实验四周后小鼠表皮的观察（（A 空白小鼠；B 未照光皮肤；C 照光后给药皮肤；D 照光后皮肤））

图2 小鼠皮肤HE染色观察

3.2 点阵激光术前后小鼠体内炎性因子的分析

图3 激光术后小鼠体内细胞因子的比较

图4 小鼠Bcl-2和P53蛋白的表达分析

组相比有显著性差异(P<0.01)，其中激光照射不给药组中的IFN-γ 分泌151.9 ± 18.5 量比点阵给药组要23.2±12.2 多。图3B 显示激光照射四周后，点阵组和给药组小鼠血清中都分泌有TNF-α，两组的TNF-α 分泌量与对照组相比有显著性差异(P < 0.01),其中点阵组中的TNF-α 分泌量为87.2 ± 13.2，给药组小鼠的TNF-α 分泌量为44.5 ± 5.6；图3C 显示激光照射四周后后，点阵组和给药组小鼠血清中的IL-6浓度分别为26.7±4.1、19.2±6.4，与对照组相比有显著性差异,其中点阵组和给药组间也有显著性差异(P<0.01)。

3.3 小鼠Bcl-2和P53蛋白的表达分析

图4A 分别为未照光小鼠的皮肤样片的Bcl-2 和P53 蛋白表达免疫组化染色。图4B 和图4C 分别为点阵组和给药组的小鼠皮肤Bcl-2 和P53 蛋白表达染色图片。图4B 可见Bcl-2 和P53 蛋白表达呈强阳性，图4C 可见Bcl-2 和P53 蛋白表达呈弱阳性。图4 为多次试验中的代表。各组Bcl-2 和P53 蛋白表达情况经单因素方差分析得：Bcl-2 和P53 蛋白28d 各组方差齐分别为（F=1.34，F=1.26，），进一步经LSD 法分析，给药组与点阵组比较Bcl-2蛋白表达差异有统计学意义。

3.4 小鼠Bcl-2和Bax蛋白的表达分析

图5 为未照光小鼠的皮肤样片的Bcl-2 和Bax 蛋白表达免疫组化染色。蛋白表达免疫组化染色。Bcl-2 蛋白表达在点阵组显示强阳性，在给药组显示弱阳性；Bax 蛋白表达在点阵组显示弱阳性，在给药组显示强阳性。图片为多次试验中的代表。Bcl-2 和Bax 蛋白表达情况经单因素方差分析得：28d 各组方差齐（F = 1.42；F = 1.38），进一步经LSD 法分析，点阵组与给药组比较Bcl-2和Bax蛋白表达差异有统计学意义；根据其数值分别与对照分析发现，Bcl-2 在点阵组中的比值要大于给药组；Bax 蛋白表达在点阵组中的比值要小于给药组；两者之间可能存在负相关。

4 讨论

图5 小鼠Bcl-2和Bax蛋白的比值分析

随着医疗美容市场的蓬勃发展，点阵激光等激光设备得到了越来越广泛的使用[7,8-10]。目前，有文献报道，点阵激光的短期副作用主要是术后疼痛、皮肤感染、色素沉着等方面。但反复多次使用的安全性未见报道。有研究报道，p53 蛋白在经过强脉冲激光长期治疗后皮肤中的表达明显高于治疗前，提示强脉冲激光治疗导致的DNA 损伤可能会引起皮肤肿瘤的发生[11]。然而，目前尚未发现能够同时抗炎修复及防癌变作用的西药。我国传统中药灵芝，早在汉代的《山海经》中记载灵芝具有“久服延年、轻身不老”的功效。我国最早的药学著作《神农本草经》也认为是滋补强壮、扶正培本的珍贵药品[12]。另外，近代研究指出，灵芝酸能调节机体的免疫分子的功能介导局部及全身的免疫活动[13]。灵芝酸在化妆品中的运用目前主要集中在抗炎、抗过敏方面，Dudhgaonkar 等[14]对灵芝三萜的抗炎活性进行研究表明，灵芝三萜能能抑制TNFα、IL-6、NO、PGE2的释放，降低机体内iNOS和COX-2的表达，陈伟也证明灵芝提取物对二甲苯鼠耳肿胀炎症具有较好的抗炎作用[15-16]。图1显示，灵芝酸能够显著改变小鼠点阵激光术后表皮生长状态，HE 染色发现灵芝酸组小鼠体内炎性细胞数量较其他点阵激光术后组别要少；图3 通过测定机体炎性因子TNF-α、IL-6、IFN-γ发现，灵芝酸给药组小鼠体内三种细胞因子与点阵组有显著性降低。这些结果与灵芝三萜的抗炎机理一致。

小鼠中的Bcl-2家族与细胞自噬相关，p53是抗癌卫士。最近，Robert 认为，细胞凋亡依赖于自噬机制。抑制Bcl-2 家族蛋白可以平衡细胞的自噬活动［17］。灵芝酸在抗氧化和抗辐射预防癌变作用与Bcl-2 和p53家族蛋白的管理机理相关。研究指出，灵芝的水提物及醇提物清除DPPH 自由基从而阻止细胞基因突变[18]。Hsu 也证明证明灵芝提取物经腹腔注射后可以提高经X 射线照射后小鼠的存活量并能提高小鼠的体重，具有良好的抗辐射作用[19]。本实验结果显示，多次点阵激光治疗后小鼠皮肤组织中Bcl-2 蛋白和p53 蛋白可出现阳性反应，但给药组小鼠皮肤组织中p53 蛋白和Bcl-2 蛋白表达明显减低，提示灵芝酸在调节细胞自噬活动及抗癌变过程中具有重要调节作用。

随着人们对“天然、绿色、安全、有效”消费理念的追求，传统药物的代表灵芝的临床价值会进一步的挖掘。通过现代技术手段的评价后，会更科学合理的服务临床。