HPLC法测定水溶性肥料植物生长调节剂的不确定度评定

段路路, 黄婧*, 王凯越

(1.上海化工院检测有限公司, 上海 200062; 2.上海化工研究院有限公司, 上海 200062)

植物生长调节剂是一类植物生长激素，在低浓度下即具有调节植物生长和发育的作用，通常由人工合成或者从生物中提取[1]。常用的植物生长调节剂有生长素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯和赤霉素等[2]。其中，脱落酸(abscisic acid, ABA)可影响植物性别分化、促进花芽分化或果实成熟等；氯吡脲(forchlorfenuron，FLFR)对植物生长的促进作用效果优异；萘乙酸(1-naphthylacetic acid，NAA)具有促进植物细胞分裂，诱导不定根形成等特点；烯效唑(uniconazole，S-3307)可抑制细胞伸长、使作物矮壮，通常作为果树、花卉等的生长延缓剂。合理使用这些植物生长调节剂可以明显提高作物的产量和品质，并能提高经济效益和社会效益。据有关学者统计，在中国境内批准登记使用的植物生长调节剂品种有38个，共587个产品[3]。目前，我国植物生长调节剂的年产量接近2 000 t，常用品种近百个，植物生长调节剂的使用一直受到社会的普遍关注[4]。

我国作为农业大国，肥料对粮食增产增效具有不可替代的作用，因此肥料的合理使用在农业生产过程中起到了积极的增产作用。由于植物生长调节剂属于农药登记的范畴，很多水溶性肥料生产企业将脱落酸、氯吡脲、萘乙酸和烯效唑等植物生长调节剂添加到肥料中，给肥料产品质量安全带来潜在风险。吴爱娟等[5]研究表明，违规或过量施的这4种植物生长调节剂，会在农作物植株中并通过食物链进入人体，被吸收后会不断积累，导致人体支端肥大、骨质疏松、恶性肿瘤等疾病，且易使儿童提前发育、过早成熟等，严重者会导致人体免疫功能下降，甚至出现致畸、致癌、致基因突变等严重后果，并对生态环境造成严重影响。因此建立水溶性肥料中植物生长调节剂的检测方法，迫在眉睫。

目前，水果、蔬菜中氯吡脲、萘乙酸、烯效唑、脱落酸等植物生长调节剂的残留常用酶联免疫法、萃取-光度法、液相色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液质联用法[6-13]等检测，其测试结果的质量需要用不确定度来表示。不确定度是与测量结果相关联的参数，用于表征合理地赋予被测量值的分散性，测量水平越高，试验质量越高，则测量不确定度越小，反之亦然。随着科技的发展，为了更合理、科学地控制食量，不确定度被广泛应用于环境监测、食药品检验等领域中。为了表征检测结果的准确性，通常采用不确定度[14-16]来对检测结果进行说明，一般可以从人的因素(人)、仪器因素(机)、物料因素(料)、检测方法因素(法)和环境因素(环)5个方面进行评定，即不确定度越小，表明测量结果越准确、越可信。目前国内外已有对肥料中植物生长调节剂检测的报道，但对于水溶性肥料中植物生长调节剂检测的不确定性评定，尚未见报道。基于高效液相色谱法具有定量准确、灵敏度高等特点，本研究拟参考化学分析中不确定度的评估指南[17]以及相关资料[18-19]，用前处理方式和HPLC条件对水溶性肥料中的氯吡脲、萘乙酸、烯效唑、脱落酸4种常见植物生长调节剂进行分析测定，从实验室采用的试验方法、标准物质、仪器设备、样品前处理过程等因素进行不确定度评定[20-21]，对不确定度的来源从人、机、料、法、环方面进行来源分析，从而建立HPLC法测定水溶性肥料中植物生长调节剂含量的不确定度数学模型，以确保数据的准确性和可靠性。研究结果表明，本研究开发出的检测方法是一个操作简单、效率高的检测系统，可为水溶性肥料行业的健康发展提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 试验材料

共选用4个水溶性肥料产品，分别编号为WSF1、WSF2、WSF3、WSF4。所用的4种标准物质为氯吡脲(纯度99.6%，德国Dr.Ehrensforfer公司)、1-萘乙酸(纯度96.9%，德国Dr.Ehrensforfer公司)、烯效唑(纯度99.8%，德国Dr.Ehrensforfer公司)、脱落酸(纯度98.0%，上海安谱实验科技股份有限公司)。试验所用主要试剂为甲醇(色谱纯)、甲酸(分析纯)。

1.2 仪器与设备

LC-20 A高效液相色谱仪(日本岛津公司)，带二极管阵列检测器(SPD-M 20 A),柱温箱(CTO-20 A)和PDA数据处理器；ME204-2电子天平(梅特勒公司)；漩涡混合器；超声波清洗器；高速离心机。

1.3 试验方法

1.3.1标准溶液配制 分别准确称取脱落酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑4种标准品0.090 0～0.110 0 g，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，溶液浓度为1 mg·mL-1，然后配置浓度依次为2、10、25、50、100 mg·L-1的标准工作溶液，现配现用。

1.3.2样品前处理 称取0.100 0～1.000 0 g水溶性肥料样品，置于10 mL离心管中，加入10 mL甲醇，涡旋振荡1 min，超声提取30 min，冷却至室温，用甲醇定容后高速离心10 min，取1 mL上清液过0.22 μm有机相滤膜，待测。

1.3.3分析条件 色谱柱选用Shim-pack C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相及梯度洗脱条件见表1，流速为1.0 mL·min-1，柱温为30 ℃，检测波长为258 nm(氯吡脲、烯效唑、脱落酸)或280 nm(萘乙酸)，进样量为10 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.3.4数学模型的建立 用以下公式对试样中脱落酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑含量建立数学模型。

式中，W指试样中脱落酸、萘乙酸、氯吡脲和烯效唑的含量(mg·kg-1)；c0指试样溶液中脱落酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑的实测浓度(mg·L-1)；V指样品定容体积(mL)；m指样品称样质量(g)。

君不行仁政而富之，皆弃于孔子者也，况于为之强战？争地以战，杀人盈野；争城以战，杀人盈城，此所谓率土地而食人肉，罪不容于死。故善战者服上刑，连诸侯者次之，辟草莱、任土地者次之。[4](P283)

(1)

urel(c0)=u(c0)/c0

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

U=2uc(w)

(9)

1.4 识别与分析测定过程的不确定度来源

根据测量步骤以及上述数学模型的计算公式分析，可得HPLC法测定水溶性肥料中植物生长调节剂含量的不确定度初步因果图(图1)。根据《化学分析中不确定度的评估指南》[12]中的规定，使用最小二乘法拟合c0的前提是,假设横坐标的不确定度远小于纵坐标的不确定度，即用于定量的工作曲线溶液浓度的不确定度足够小，以致于可以忽略不计。

图1 植物生长调节剂测定的不确定度来源因果图

2 结果与分析

2.1 最小二乘法拟合标准溶液浓度引入的不确定度

为校准高效液相色谱仪，采用准确称量脱落酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑的标准物质配制成2、10、25、50、100 mg·L-15种浓度的标准工作溶液，每种标准工作溶液用高效液相色谱仪测定3次，可以得到相应的峰面积A，用最小二乘法拟合，得到每种标准工作溶液的直线回归方程A=a+b×c(a为线性方程的截距，b为线性方程的斜率)和R2(表2)。R2值均大于0.999，表明4种生长调节剂标准工作溶液的浓度与高效液相色谱仪测定的响应值显著正相关，用此方法测量的精密度较高。

表2 4种植物生长调节剂最小二乘法拟合的线性关系

由浓度—峰面积最小二乘法拟合求得试样溶液的浓度(c0)，则c0的标准不确定度[u(c0)]和相对不确定度[urel(c0)]参照1.3.5中公式(1)和(2)计算，因为每种植物生长调节剂测试3次，检测了4种植物生长调节剂，因此式中n=3×4=12；测定次数(p)为1。4个样品的u(c0)和urel(c0)计算结果见表3。

表3 标准工作溶液最小二乘法拟合引入的不确定度

2.2 试样称样引入的不确定度

表4 样品称量引入的不确定度

2.3 试样溶液定容引入的不确定度

2.4 试验过程随机效应引入的不确定度

表5 测量过程随机效应引入的不确定度

2.5 合成不确定度和扩展不确定度的计算

根据以上研究，水溶性肥料样品中脱落酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑含量测定产生的不确定度包括标准工作曲线线性拟合引入的不确定度、样品称重产生的不确定度以及样品重复性测定引入的不确定度。因此，采用HPLC法测定水溶性肥料中4种植物生长调节剂的相对合成不确定度[ucrel(w)]和合成不确定度[uc(w)]，参照1.3.5中公式(7)和(8)。

在95%置信度水平下，取扩展因子(k)为2，则HPLC法测定植物生长调节剂的扩展不确定度为：U=2×uc(w)，按照此公式计算4个样品中脱落酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑的不确定度，结果(表6)可知，相对合成不确定度的来源主要是样品浓度测定中标准曲线的拟合引入的不确定度和样品重复测定引入的不确定度。

表6 样品中脱落酸、萘乙酸、氯吡脲、烯效唑的不确定度

图2 4种生长调节剂扩展不确定度与含量的线性拟合

3 讨论

不确定度是用于说明测量分散性的参数，由分析和评定得到，科学的评估方法是关键。不确定度评定是提高检测质量要求的主要内容，不确定度越小，表明测量结果越准确可信。不确定度评定主要包括以下几个步骤：①规定被测量不确定度；②识别不确定度的来源；③不确定度分量确定并计算；④计算合成不确定度；⑤报告不确定度。本研究建立了HPLC法测定水溶性肥料中脱落酸、萘乙酸、氯吡脲和烯效唑含量的测试系统，并对测定过程中不确定度来源的各个分量进行分析。研究发现，建立的HPLC检测方法测定水溶性肥料中不同植物生长调节剂的不确定度数学模型，是一个操作简单且效率高的检测系统。

本研究发现，影响HPLC法测定水溶性肥料中植物生长调节剂含量的测量不确定度主要有两个来源，一是定量测定中使用标准物质配置成标准工作曲线的线性拟合引入的不确定度，二是样品测试过程中引入的随机效应即重复测定，而使用的不同标准物质的纯度、样品的称量、样品前处理等引入的不确定度对最终的合成不确定度影响不大。郭霞等[23]用HPLC法测定了复混肥料中缩二脲含量的不确定度，得出影响结果的主要不确定度分量为拟合校准曲线引入的不确定度；郝霞莉等[24]用高效液相色谱法检测了脱毛类化妆品中巯基乙酸含量的不确定度，认为主要不确定度来源于标准曲线拟合、标准溶液配制以及试样测量重复性；肖利龙等[25]通过HPLC法研究了花生酱中黄曲毒素B1结果的不确定度评定，认为影响检测结果的6个不确定度分量中，样品前处理过程和标准工作液配制引入的不确定度对结果影响较大；牛日华[26]采用液相色谱法对水产品中恩诺沙星残留量进行检测，发现测定结果的不确定度主要来源于样品前处理和标准溶液；李煜婷等[27]用固相萃取-高效液相色谱法测定了土壤中苯并(a)芘的不确定度，研究表明，标准曲线拟合和标准溶液配置产生的不确定度对合成不确定度的影响较大，而样品称量所引入的不确定度较小，可忽略不计；刘文星[28]研究了液相色谱法测定戊醛中催化剂不确定度的评定，其中标准物质的纯度、标准样品和样品测量重复性对测量不确定度的影响较大。可见上述研究与本研究类似，均表明用HPLC法测定食品、化工品、土壤、肥料等不同基体中的特定物质含量的不确定度评定中，主要不确定度来源为标准溶液配制和线性拟合；此外，由于研究对象基体不同，样品测定重复性对不确定度的贡献也较大。因此，建议在分析过程中，实验人员应首先评估实验过程中引起不确定度的各个分量的贡献，排除不重要的分量，同时熟练掌握操作步骤，提高标准工作曲线的准确性和可靠性，增加平行测定次数，从而保证实验结果的可靠性和准确性。本研究为水溶性肥料中其它植物生长调节剂含量测定的不确定度评定提供理论参考和依据。