聚集诱导发光分子/适配体/外切酶Ⅰ体系对可卡因的检测

杜宪超,郝红霞,秦安军,唐本忠,3

(1. 华南理工大学发光材料与器件国家重点实验室,广东省分子聚集发光重点实验室,聚集诱导发光研究中心,广州 510640;2. 中国政法大学证据科学教育部重点实验室,2011计划司法文明协同创新中心,北京 100088;3. 香港科技大学化学系,国家人体组织重建工程技术研究中心香港分中心,香港)

目前非法药物的滥用已经成为全球性的公共安全卫生问题之一[1～3]. 其中可卡因作为一种全球禁用的非法药物,长期滥用会对人体造成许多不良的影响,如精神疾病、失眠、抑郁和暴力倾向等,甚至威胁生命,同时,吸食可卡因还会导致出现各种社会问题[4,5]. 因此实现对可卡因的快速检测成为打击毒品犯罪、维护社会稳定的关键. 目前对于可卡因的检测主要采用气相色谱/质谱(GC/MS)和液相色谱/质谱(LC/MS)等大型仪器. 虽然能够实现对可卡因检测,但大多需要专业人员操作且耗时较长,因此开发一种简便、高效且可靠的可卡因检测方法成为研究的热点[6～8]. 其中,基于荧光探针的检测手段由于具有高效、灵敏及便捷等优势而备受关注,但传统的荧光探针面临聚集导致发光猝灭(ACQ)的难题[9,10],即这类分子在溶液中发光非常强,一旦聚集或在固体中发光显著减弱,非常不利于实际应用.

聚集诱导发光(AIE)[11～13]可从根本上解决ACQ的难题,是设计荧光传感材料和显像剂的理想选择[14～16]. AIE是我们团队提出的一个科学概念,是指在溶液状态不发光或者发光微弱的分子聚集后或在固态下发光显著增强的现象,但利用AIE探针对非法药物的检测鲜见报道. 本文基于AIE探针分子开展了对非法药物可卡因的检测研究,同时为进一步提高检测的灵敏度和选择性,引入适配体与外切酶Ⅰ(Exo Ⅰ)进行协同(反应过程见Scheme 1).

适配体是一种通过体外指数富集技术(SELEX)合成的具有特定序列的寡聚核苷酸[17,18],可以与特定的靶标物进行高选择性和高特异性结合,形成特殊的三级结构. 由于这些独特的功能,使适配体在生物传感器的开发中具有巨大的潜力[19～24]. 核酸外切酶Ⅰ(Exo Ⅰ)作为一种特殊的核酸酶,能够从末端或内部裂解核酸核苷酸之间的磷酸二酯键,将单链DNA分解成磷酸和单个核苷酸,而Exo Ⅰ对双链DNA或是特殊三维结构的DNA没有效果. 基于Exo Ⅰ优异的选择性,目前其已经被应用到小分子、蛋白质和无机盐离子的检测中[25,26].

Scheme 1 Schematic illustration of detection of cocaine by the system of AIEgen,aptamers and exonuclease Ⅰ

研究结果表明,以AIE分子4,4′,4″,4″′-四(4-丁氧基三乙基溴化铵)四苯基乙烯(TPE-TTA)作为荧光探针分子,适配体作为识别单元,Exo Ⅰ作为辅助,可成功实现对水相及尿液中可卡因的快速检测,其最低检出限可分别达0.66和1.0 μmol/L.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器 4,4′-二羟基二苯甲酮、1,4-二溴丁烷和四氯化钛购于阿拉丁试剂有限公司; 可卡因适配体及Exo Ⅰ由上海生工生物工程股份有限公司合成,适配体经高效液相色谱(HPLC)纯化,其碱基序列为5′-GGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCGACA-3′; 其它试剂及无机盐均为市售分析纯.

Bruker AV 400/500 MHz核磁共振波谱(NMR)仪,德国Bruker公司; Horiba Fluoromax-4型荧光光谱仪,日本HORIBA公司; SENS-9000型分子荧光光度仪,北京卓立汉光仪器有限公司; 岛津UV-2600型紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱仪,日本岛津公司; Hamamatsu C11347型绝对荧光量子产率光谱仪,日本滨松光子学株式会社; Malvern MicroCal型等温滴定量热(ITC)仪,英国马尔文仪器公司.

1.2 实验过程 如Scheme 2所示,参照文献[27]方法合成4,4′-二(4-溴丁氧基)二苯甲酮(1)和4,4′,4″,4″′-四(4-溴丁氧基)四苯基乙烯(2)(1H 和13C NMR谱图见图S1～图S6,见本文支持信息).

Scheme 2 Synthetic routes of TPE-TTA

根据Scheme 2的路线合成探针TPE-TTA. 将0.3 g(0.32 mmol)化合物2和15 mL三乙胺置于圆底烧瓶中,加入50 mL四氢呋喃(THF),加热回流72 h; 缓慢加入10 mL水; 反应结束后,通过旋转蒸发除去四氢呋喃,得到黏稠的油状粗产物; 用THF洗涤多次,得到0.369 g透明的油状化合物TPE-TTA,产率86%.1H NMR(400 MHz,DMSO-d6),δ: 6.84(d,J=8.7 Hz,8H),6.71(d,J=8.7 Hz,8H),4.01～3.84(m,8H),3.30～3.17(m,32H),1.78～1.65(m,16H),1.17(t,J=6.8 Hz,36H).13C NMR(125 MHz,DMSO-d6),δ: 157.19,138.52,136.81,132.46,114.21,66.98,56.16,52.52,26.04,18.51,7.67.

将可卡因适配体离心后溶于去离子水中,配成浓度为100 μmol/L的母液,并存放在4 ℃冰箱中; 将可卡因溶解于Tris-HCl(25 mmol/L Tris-HCl,0.15 mol/L NaCl,2 mmol/L MgCl2,pH=8.0)缓冲溶液中,配成1 mmol/L的母液储存于4 ℃冰箱中备用.

2 结果与讨论

2.1 AIE性质 首先测试了探针分子TPE-TTA的光物理性质,由图S7(见本文支持信息)可见,TPE-TTA在甲醇溶液中具有较好的溶解性,几乎不发光(荧光量子产率为0.8%). 随着不良溶剂甲苯的增加,TPE-TTA发生聚集,导致分子内苯环旋转受到限制,从而产生荧光(95%甲苯/甲醇溶液荧光量子产率为25.4%). 同时,测得TPE-TTA在固态时荧光量子产率为62.7%,由此证明其是一个AIE分子.

2.2 传感平台可行性分析 采用ITC测试了可卡因与适配体之间的作用力. 由图S8(见本文支持信息)可见,可卡因与适配体具有很好的结合能力,为实验的可行性提供了重要的依据. 为了证实带正电荷的探针分子可以与适配体相互结合,进行了荧光光谱监控下适配体对探针分子的滴定实验. 由图1(A)可见,随着适配体的加入,探针分子TPE-TTA在480 nm处的荧光强度逐渐增强. 这是由于探针分子与适配体相互结合导致TPE-TTA内苯环的旋转受到限制[28],因此荧光增强,这也可以通过加入适配体前后的吸收变化得以证实(图S9,见本文支持信息).

Fig.1 Photoluminescence(PL) spectra of TPE-TTA in Tris-HCl solution upon addition of anticocaine aptamer from 0 to 0.2 μmol/L(A) and exonuclease-mixture treated and untreated anticocaine aptamer in the presence or absence of cocaine(B)λex=340 nm; c(TPE-TTA)=5 μmol/L. (B) c(anticocaine aptamer)=0.2 μmol/L.

可卡因适配体在可卡因存在下可使单链适配体盘旋折叠成Y型双链三维结构[29],加入Exo Ⅰ后,将无法切割适配体,因此在加入TPE-TTA后荧光点亮,而没有作用的适配体将被分解,且对探针的荧光发射不产生影响. 基于上述原理,我们将可卡因与适配体共同孵育一段时间后,加入Exo Ⅰ,再孵育一段时间,向溶液中加入探针分子TPE-TTA,与未加入可卡因的适配体进行对比,发现只有在加入可卡因时探针荧光增强,进一步证实该传感器可以实现对可卡因的检测[图1(B)].

2.3 最佳实验条件的选择 为了确定检测可卡因的最优条件,进行了一系列的条件优化实验,包括Exo Ⅰ用量、Exo Ⅰ与适配体孵育时间及可卡因与适配体孵育的温度和时间. 为了获取Exo Ⅰ的最佳降解浓度,对酶活性进行了考察. 固定适配体的浓度为0.2 μmol/L,TPE-TTA浓度为5 μmol/L,将不同浓度的Exo Ⅰ(0,3,6,9,12,15,18和21 U)添加到缓冲溶液中,测试其荧光光谱[图2(A)]. 随着Exo Ⅰ浓度的提高,越来越多的适配体被切割成单个的核苷酸和磷酸,导致TPE-TTA周围的苯环无法被限制运动,溶液的荧光强度逐渐下降,当Exo Ⅰ浓度到达15 U时,荧光强度达到最小,表明适配体完全被降解. 因此,选定15 U的Exo Ⅰ作为最佳浓度进行后续实验以优化参数.

Fig.2 PL spectra of anticocaine aptamer/TPE-TTA in buffer with addition of Exo Ⅰ(A) and plots of relative PL intensity of sensing system versus incubation time of Exo Ⅰ with anticocaine aptamer(B),cocaine incubation temperature with anticocaine aptamer(C) and incubation time of anticocaine aptamer with cocaine(D)λex=340 nm,c(anticocaine aptamer)=0.2 μmol/L; c(TPE-TTA)=5 μmol/L.

以15 U的Exo Ⅰ考察Exo Ⅰ与适配体孵育时间对体系的影响[图2(B)]. 由图2(B)可见,随着时间的延长,荧光强度降低明显并慢慢趋于平缓,30 min后荧光强度基本不再变化,因此,选择30 min作为最佳反应时间.

温度对可卡因与适配体结合的影响不大. 由图2(C)可见,在不同温度下(20,25,30,35,40 ℃),荧光强度随温度变化产生微小的变化,在25 ℃下荧光强度达到最大,因此选择25 ℃作为适配体的最佳孵育温度.

对可卡因与适配体的孵育时间进行了考察. 由图2(D)可见,随着可卡因孵育时间的延长,体系荧光强度逐渐增强并慢慢趋于稳定,说明可卡因与适配体逐渐趋于平稳饱和,进而荧光变为平稳. 因此选择45 min作为可卡因与适配体最佳的孵育时间.

2.4 灵敏度检测 在最优条件下,研究了传感器对可卡因检测的灵敏度. 探针体系荧光强度随不同浓度可卡因的变化[图3(A)]表明,与空白样品相比,随着可卡因量的增加,其荧光强度不断增强,并且在0～100 μmol/L范围内表现出很好的线性关系. 由图3(B)推导出检出限(LOD)为0.66 μmol/L(S/N=3).

Fig.3 PL spectra of sensing system upon addition of cocaine in buffer solution(A) and the plot of relative intensity versus cocaine concentration(B)Inset of (B): the plot with cocaine concentration from 0 to 100 μmol/L. λex=340 nm; c(anticocaine aptamer)=0.2 μmol/L; c(TPE-TTA)=5 μmol/L.

选取不同种类的其它非法药物(吗啡、咖啡因、美沙酮、甲基苯丙胺、氯胺酮和MDPA)与可卡因进行对照实验(图S10,见本文支持信息). 结果表明,在同等条件下,由于其它非法药物无法与适配体形成Y型双链结构,在加入Exo Ⅰ后被降解. 因此只有可卡因在加入TPE-TTA后荧光强度明显增强,其它干扰物几乎没有引起TPE-TTA荧光的变化,表明该传感器可以实现对可卡因的选择性识别.

为了验证该传感器可以对实际样品中的可卡因进行检测,选择实际尿液作为检测对象,在相同条件下,将实际尿液进行稀释,向其中掺入不同浓度的可卡因进行荧光光谱测试. 由图S11(见本文支持信息)可见,随着可卡因掺入量的增加,荧光强度不断增强. 在一定范围内呈现线性增强,通过计算得到最低检出限为1.0 μmol/L. 为了验证该荧光传感器在实际样品中同样具有很好的选择性(图S12,见本文支持信息),对其它的非法药物进行了选择性检测,发现只有在可卡因存在下其荧光强度才能增强,证实该传感器具有在实际样品中检测可卡因的潜在应用价值.

值得指出的是,与传统的荧光探针分子相比,本文采用的AIE探针具有绝对的优势. 由图S13(见本文支持信息)可见,在相同的条件下,选取了2种常用的荧光探针分子罗丹明B与吖啶橙进行适配体滴定的荧光测试. 结果表明,TPE-TTA在极微量的适配体存在下即可以引起较大的荧光变化,而其它探针分子基本没有响应. 另外,与可卡因检测试剂盒相比,本文的检测方法与其具有类似的检出限且具有很好的选择性[30,31]; 而与应用较为广泛的仪器分析及电化学传感相比,该荧光传感器在保证较低检出限的前提下可以有效地避免大型仪器不利于即时检测及价格昂贵的问题,同时还避免了电化学传感中时间稳定性差导致的频繁校准和电极结垢问题[32～35]. 上述结果说明,AIE探针及检测手段具有较大的商业化应用潜力,有利于快速打击毒品犯罪和维护社会稳定.

综上所述,本文开发了一种基于AIE分子/适配体/外切酶Ⅰ体系的检测手段,通过荧光强度的变化可实现对可卡因的高灵敏、高选择性检测. 该体系不仅能在缓冲溶液中,而且能在尿液中实现对可卡因的检测,其检测限可分别低至0.66和1.0 μmol/L,且不受其它非法药物的干扰. 与其它检测方法相比,这种荧光传感器大大节省了实际样品前处理的时间,为现场快速检测可卡因提供了依据. 同时该传感器设备简易,操作简单,具有实现小型化检测的潜质.

支持信息见http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20190681.